人类HDAC4和MIF4GD蛋白相互作用的初步研究.pdfVIP

第47卷 第5期 复旦 学 报 (自然科学版) V01．47No．5 2008年 10月 JournalofFudanUniversity(NaturalScience) Oct．2008 文章编号：0427—7104(2008)05—0568—08 人类HDAC4和 MIF4GD蛋 白相互作用的初步研究 吴冬华，周 娟，单敬轩，施慧莉，霍克克 (复旦大学 生命科学学院遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室，上海 200433) 摘 要：以HDAC4为 “诱饵”，利用酵母双杂交系统筛选人肝cDNA文库得到 “猎物”蛋白，通过GSTPull—down， Co-IP，荧光共定位等技术验证HDACA和 “猎物”的特异性结合，并通过成人多组织cDNAPanel确定 “猎物”的组 织表达谱．通过体内、外蛋白结合实验证实了HDACA与MIF4GD(MIF4Gdomaincontaining)蛋白特异性互作，且 两者亚细胞共定位于细胞质内，并确定了MIF4GD在胎盘、肝脏和胰腺中有特异性表达．本实验发现并验证了 HDACA与MIF4GD的特异性互作，并确定了MIF4GD的特异性表达谱，为深入研究两种蛋白的功能及其所参 与的生理过程提供了新的线索． 关键词：HDACA；MIF4GD；酵母双杂交；蛋白质相互作用 中图分类号：Q7l 文献标识码 ：A 组蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetylase，HDAC)是真核生物中一类重要的调控基因表达的蛋 白，它们 参与细胞生长、周期调控、发育、分化和存活等多种生理活动的调节．全面抑制 HDACs可导致细胞生长受 抑、癌细胞凋亡、肿瘤生长状态改变等 J，HI)ACs可以作为癌症治疗的靶标 2,3]．根据序列相似性和蛋白 结构特点，可将人中发现的t-IDACs分为三类 ：第一类HDACs与酵母 Rpd3同源，包括 HDAC一1，2，3，8；第 二类与酵母Hdal同源，又分两个亚类，IIa包括HDAC-4，5，7，9，lib包括HDAC-6，10；第三类与酵母 Sir2 同源，包括SIRT1—7．本文以HDACA为研究对象，它含一个受钙信号调节的N端结构域和一个具有催化 活性的C端结构域，N端结构域介导其与各个转录因子的相互作用，并富含保守的谷氨酰胺区域，可独立 抑制转录l4]．HDAC4的N端含NLS，c端含NES，故可以在核质之间穿梭_5J．～些胞外信号和胞内蛋白通 过调控其亚细胞定位而对其进行调节 o，．最初人们发现HDACA可以与转录因子MEF2相结合，通过抑 制其转录活性而影响肌细胞分化 8,9；后来越来越多的研究证实，HDAC4还能与多种蛋白相互作用，参与 DNA损伤l加]、神经元细胞死亡l1川、骨形成 12j等一系列细胞活动．然而，HDACA在各类细胞活动和相关疾 病中的确切作用机制尚未研究清楚． 为了探究I-tDACA在人类特定组织肝脏中的作用机制，我们将 HDACA作为 “诱饵”，利用酵母双杂交 技术筛选人肝cDNA文库，寻找其特异性互作蛋白，并对新发现的互作蛋白进行了验证． 1 材料与方法 1．1 试剂和材料 ProQuestTMGal4酵母双杂交系统及人肝 cDNA文库购 自美国Invitrogen公司．HDAC4基因的全长 cDNA克隆购 自武汉三鹰生物技术有限公司．TaqDNA聚合酶、DNA限制性内切酶、T4DNA高效连接试 剂盒、DNAMarker和pMD18一T载体购 自TaK a(大连)公司．氨基酸Dropout混合物、酵母培养基：SC／- Leu(sc．L)，SC／-Trp—Leu(SC_TL)，SC／-Ura—Trp—Leu(SC-UTL)，SC／-His—Trp—Leu(SC-HTL)、细胞培养 基DMEM、小牛血清和细胞转染试剂 Lipofectamine均购 自美国Invitrogen公司．鲑鱼精单链DNA(ssssD— NA)购自博大泰克(北京)公司．3一AT (3-amino一1，2，4-triazole)和x—ga1粉末购 自Sigma公司．蛋白预染分 收稿 日期：2008—02—06 基金项目：国家高技术研究发展计划 “八六三”资助项 目(2006AA02A310)，上海市科技创新 团队计划资助项 目 (03DZ14024) 作者简介：吴冬华(