大鼠肺组织单细胞悬液制备方法的研究.pdfVIP

· 1060 · I临床与实验病理学杂志 JClinExpPathol2012Sep；28(9) 大鼠肺组织单细胞悬液制备方法的研究 高 丽 ，孙德俊 ，杨敬平 ，李姝楠 ，贾宇辰 关键词：单细胞悬液；大鼠肺组织 ；流式细胞术 中，用磷酸缓冲液(PBS)清洗肺组织 ，从同一大鼠肺脏中取 中图分类号：R361+3 文献标志码 ：B 大小相当的两个新鲜组织块 (直径约 1cm)，分别用0．25％ 文章编号：1001—7399(2012)09—1060—02 胰酶消化法和机械研磨法制备肺组织悬液。 1．3．1 胰酶消化法 无菌术开胸取适量大小的肺组织，用 流式细胞术(flowcytometry，FCM)中细胞的分析检测均 PBS反复冲洗，剪碎至糊状 ，移入离心管，离心(800r／min×5 以单个细胞为基础 ，而各种单细胞悬液的制备是其中的关键 min)，弃上清，0．25％胰酶消化 (在培养箱中消化)30min，期 环节，若细胞数量不足、细胞粘连成块、样品中杂质碎片过多 间每隔10min将消化细胞吹打均匀 ，再离心，弃上清 ，加少 均可造成分析失败 。。本实验采用胰酶消化法和研磨法 量含有胎牛血清的DMEM终止消化 ，加PBS过 100钼筛网， 制备新鲜大鼠肺实体组织单细胞悬液，通过细胞活力测定、 PBS洗2次离心弃上清，4％多聚甲醛固定 10min，细胞计数 FCM检测分析比较两种方法优劣。 后上机检测。 1．3．2 机械研磨法 将肺组织剪成小块，放入 70ml组织 1 材料与方法 研磨器内加入2mlPBS，缓慢转动研棒研磨至匀浆，用 l0ml 1．1 试剂与仪器 FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公 PBS冲洗研磨器 ，收集细胞悬液经 100钼筛网过滤，离心沉 司)；台盼蓝 (Sigma公司)和 荧光素 (PE)标记 的 —SMA兔 淀800r／minX5min再用PBS洗3次离心沉淀，余下步骤同 抗人单克隆抗体 (RD公司)；MoticAE21倒置相差显微镜 消化法。 (厦 门Motic公司)。 1．4 形态学观察及细胞活性测定 分别取两种方法制备的 1．2 测定标本 取Wistar大鼠12只，雌雄各半，由内蒙古 肺细胞悬液，在倒置相差显微镜下观察其形态学变化。取 9 大学实验动物中心提供，按文献 方法制备肺组织纤维化模 滴各组细胞悬液加 1滴台盼蓝溶液混匀后于4℃冰箱静置 型，切取肺组织，检测各项指标。 20rain用血小板记数板在光镜下分别记数活细胞和死细胞 1．3 单细胞悬液的制备 无菌条件取大鼠肺组织放人平皿 数 目。 1．5 FCM 检测 PE标记的0一【SMA抗体表达的阳性细胞 收稿 日期：2012—06—11 计数方法：各取两种方法制备的大鼠肺组织单细胞悬液，4％ 作者单位：内蒙古 自治区人民医院呼吸内科，呼和浩特 010017 多聚甲醛固定 10rain(细胞计数，浓度为 1O。个／m1)，PBS清 内蒙古医科大学第三附属医院呼吸与危重症医学科，包 洗2次，800r／min各离心5min，细胞穿孔剂 (0．1％TritonX 头 014000 100+0