大鼠脑组织原位杂交染色的几点体会.pdfVIP

维普资讯 ·49O · 临床与实验病理学杂志 JClinExpPathol 2004Aug：20(4) 大 鼠脑组织原位杂交染色的几点体会 张丽红 李玉林 李一雷 李 伟 【关键词】 脑 ；原位杂交；大 鼠；染色法 【中图分类号1 R4468 【文献标识码】 B 【文章编号】 1001—7399(2004)04—0490—02 ， 近年来 ，原位杂交技 术的发展和方法 的不断改进 ，已广 f f 泛地应用于组织 内的靶 RNA定量定位分析。但 由于组 织 ● 的来源不同，进 行原位杂 交染色组织 的各期处 理也不尽 相 同，尤其是脑组织 中其含大量磷脂成分，质地柔软 ，原位杂交 染色一直难 以取得令 人满意 的结果 。本实验室采用大 鼠脑 图 l 脑组织 中 casp~lsc3mRNA表达 阳性 ．原位杂交 缺血模型进行 caspase-3原位杂交染色，结果较为理想。 3．1 组织的固定 由于脑组织内的mRNA很容易降解 ，所 1 材料与方法 以组织固定应越新鲜越好 。但新鲜的脑组织 比较柔软 ，为了 1．1 材料 58例大 鼠脑缺血模型，caspase-3原位杂交检测 使脑组织的大体形态和组织 内的mRNA得以更好 的保存 ， 试剂 (购于武汉博士德公司)，DAB显色液 (购于福州迈新生 应先进行 内固定而后进行外固定。固定时间可 根据情况进 物技术开发有限公 司)。 行适 当调整 。如果内固定时间长 (短，外固定时间就应相对 1．2 方 法 缩短 (延长)。如果固定时间过 长，不但组 织 内的 mRNA杂 l_2．1 脑组织的固定 先进行 内固定 ，方法是把缺血模型 交信号会减弱 ，而且脑组织会变脆 ，影响切片及染色效果；固 定时间过短 ，不论是脑组织的形态结构还是核酸的保存都不 的大鼠，用 1O 水合氯醛腹腔麻醉后 ，在手术显微镜下取出 理想 。 栓线，使血流再通 。然后剪 开胸 腔，暴露 心脏 。从左心尖插 入 7号针头 ，滴入 0．9 的温生理盐水 ，剪开右心耳 ，待右心 3．2 脱水时间 大 鼠脑组织经固定后 ，必须经用 0．1mo|／ 耳流 出的液体颜 色变 淡时 ，改用 4 多聚 甲醛液 灌注 3O LPBS冲洗 。如果直接进行脱 水，组织会急剧收缩 ，切片时 min。大 鼠四肢抽搐 、震颤，说明灌注成功 。取脑，沿横断面 组织上会出现皱褶，且很难展开 ，染色时 既容易脱片且影响 染色效果 。，因为脑组 织 内含有大量 的磷 脂，所 以在 95 乙 切成 0．3cm厚的组织块 ，用 4 多聚甲醛进行后固定。 1．2．2 组 织的脱水、包埋 大 鼠脑组织 经 固定后 ，用 0．1 醇 中脱水时应延长时间。 3．3 防脱片剂 的浓度 现在常用 的防脱 片剂为多聚赖氨 mol／LPBS洗 10min×2，之后用 0．1mol／LPBS浸泡 ，4℃ 酸 ，试剂说明书推荐浓度为 1：9(多聚赖氨酸 ：水)，适 用于 冰箱过夜 。第 2天开始脱水 。具体在 乙醇中的时间为 8O 12h，95％ I 12h，95 II24h，100