真鲷虹彩病毒实时定量PCR检测方法的建立应用.pdfVIP

201l食品安全技术与标准国际研讨会暨AOAC中国区会议论文集 真鲷虹彩病毒实时定量PCR检测方法的建立与应用，Ic 强2，岳志芹1宰奉 (1．山东出入境检验检疫局技术中心山东青岛266002； 2．深圳出入境检验检疫局水生动物疫病国家重点实验室广东深圳518010) 摘要：以真鲷虹彩病毒(red-seabream iridovims，RSIV)主要衣壳蛋白(majorcapsidprotein，MCP)的基因的保 Green 守片段为靶序列，利用Primer 3．0软件设计定量PCR引物，建立了RSIV的SYBRI实时定量PCR检 Express 测方法。将RSIV MCP基因连接pMD8．T载体，构建重组质粒，经过梯度稀释后作为标准品，根据标准品拷贝数(x) 与ct值的关系绘制了标准曲线，为Ct=一3．184 的Tm值为82．5℃。该方法的检测限为2．20x102拷贝／反应，对流行性造血器官坏死病毒、淋巴囊肿病毒、蛙病毒3、 甲鱼虹彩病毒都没有扩增反应，具有特异性。利用该方法对84批海水鱼类(石鲽、大菱鲆、鲈鱼)进行检测，其中 5批鱼样品感染RSIV，并利用标准曲线对病毒含量进行了定量分析。本实验建立的实时定量PCR检测方法，具有 灵敏度高、特异性好、快速、简便、准确等优点，可以广泛应用于RSIV的病原检测和致病机理研究方面。 GreenI 关键词：真鲷虹彩病毒；实时定量PCR；衣壳蛋白基因；SYBR etal．2003)， 主要感染真鲷、花鲈、条石鲷等海水鱼类，患病鱼类主要表现为昏睡、严重贫血、鳃上游瘀斑、脾肿大等症 状，该病在自然界暴发时大多数很突然，难以治疗，致死率高，是目前对各国海水养殖危害最为严重的疾病 International 之一(孟庆显等，1996；Office Des 鉴于RSIV的危害性，该病被国际兽疫局(OIE)列入必检疫病名录，我国农业部在新公布的“一、二、三类 动物疫病病种名录”(中华人民共和国农业部公告第1125号)中将其列为二类疫病，韩国实施的新“水生动 物疾病管理法”中要求在入境的真鲷、牙鲆、大黄鱼、花鲈、条纹鲈等35种鱼类中必须进行RSIV的检验检 疫。 水生动物病原的检测方法主要有组织病理学检测、细胞培养技术、免疫学检测和分子生物学检测技术(萧 InternationalDes 有合适的细胞培养系、免疫学检测范围窄且存在交叉反应的现象(Office 规PCR方法操作冗繁，检测结果需要测序确证，耗时长，不能满足病毒检测周期短、业务量大的要求：灵敏 etal．2003)。 度有限，对病毒感染初期的水生动物病害的监测还存在一定缺陷(Caipang 实时定量PCR方法，具有灵敏、快速、准确、可以定量的优点，利用荧光染料插入已合成的双链DNA 中即可产生荧光信号的原理，可以实现检测信号的增大与PCR扩增鼍的增长的同步，检测结果不需电泳，被 实时定量PCR检测方法的报道。本实验以RSIVMCP基因保守片段为靶序列，设计特异性引物，建立了RSIV 的SYBRGreen I的实时定量PCR检测方法，以期为RSIV提供一种新的快速定量检测方法，并应用该方法 资助项目：国家质量监督检验检疫总局科研项目(20071K267)，质检总局公益性项目(10．71)。 作者简介：赵玉然(1983．)，女，硕十。研究方向．水生动物疫病检验检疫。E-maih ran-007@163．Com ¨通讯作者：岳志芹．女，高级工程师，0