TUNEL联合免疫组化方法.docVIP

TUNEL联合免疫组化的实验步骤 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光) 1、常规程序制备石蜡组织块和5 wm厚石蜡组织切片。 2、然后按照TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的标准步骤进行TUNEL染色。 对于石蜡切片：? a.?二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。? b.?滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。? c.?用PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。? d.?在用PBS配制的3%过氧化氢溶液(3%?H2O2?in?PBS)中室温孵育10分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用PBS或HBSS洗涤3次。注：请勿在用PBS配制的3%过氧化氢溶液中孵育过长时间，否则会出现过氧化氢导致的DNA断裂，从而产生假阳性。 e. 配制生物素标记液：? 参考下表配制适量的生物素标记液，需充分混匀。注意：配制好的生物素标记液必须一次使用完毕，不宜冻存。? f.?样品的生物素标记：? 1.?在样品上加50μl?生物素标记液，37℃孵育60分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少生物素标记液的蒸发。? 2.?用PBS或HBSS洗涤1次，滴加0.1-0.3ml标记反应终止液，室温孵育10分钟。? 3.?用PBS或HBSS洗涤3次。? g.?Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液的配制：??a.?Streptavidin-HRP工作液的配制：?? 参考下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混匀。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。? ?h. ?DAB显色液的配制：? 按照每个样品使用0.2-0.5ml显色液的比例配制适量DAB显色液。等体积混合适量DAB显色液A和DAB显色液B，充分混匀后即为DAB显色液。注意：配制好的DAB显色液必须一次使用完毕，不宜冻存。? i. 样品的DAB显色：? (1)?在样品上加50μl?Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少Streptavidin-HRP工作液的蒸发。? (2)?用PBS或HBSS洗涤3次。? (3)?滴加0.2-0.5mlDAB显色液，室温孵育5-30分钟或根据显色情况孵育适当时间。注：如果显色很强可以短于5分钟即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。? (4)?用PBS或HBSS洗涤3次。? (5) 选做(本步骤可不做)：用苏木素染色液(C0107)或甲基绿染色液(C0115)进行细胞核染色。随后用PBS或HBSS洗涤3次。? (6)?直接进行观察，或用95%乙醇脱水5分钟，再用100%乙醇脱水2次，每次约3分钟，再用甲苯透明2次，每次5分钟，随后封片观察。染色结果可参考下图： TUN EL显色完毕后，切片人o. O5%Tween-20的PBS缓冲液中，置千加温摇床上洗3遍，浸泡于PBS中10 min,然后进行免疫组织化学染色。 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5、 PBS冲洗，5分钟×3次。 6、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 7、 PBS冲洗，5分钟×3次。 8、 显色剂显色（DAB或AEC）。 荧光TUNEL联合免疫荧光的实验步骤 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法) 1、常规程序制备石蜡组织块和5 wm厚石蜡组织切片。 2、然后按照TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的标准步骤进行TUNEL染色。 对于石蜡切片： a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。 b. 滴加20?g/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。 c. PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。 3、 配制TUNEL检测液： 参考下表配制适当量的TUNEL检测液，需充分混匀。注意：配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。 a. 用PBS或HBSS洗涤2次。 b. 在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。