PCR方法鉴别动物血球蛋白粉来源.pdfVIP

《词斟工业》2·009缶第30肇纂Z墅 PCR 方 法 鉴 别 动 物 血 球 蛋 白粉 的来 源 武艳军 刘思国 陈建泉 马梓力 龚道清 张 军 成国祥 血球蛋 白粉 (Spray—driedanimalbloodcellsSDBC) 血球蛋 白粉的DNA提取和 PCR反应条件进行摸索 是指动物血液在低温条件下，经一定工艺分离出血球 优化 ．建立 了一套切实可行的PCR检测动物血球蛋 后．经喷雾干燥获得 的一种高品质动物蛋 白原料 。它 白粉来源的方法。 营养丰富、适 口性好 、消化率高 ，被广泛应用于早期断 1 材料与方法 奶仔猪和哺乳母猪 日粮中。不过 ，血液制品的生物安 1．1 样 品 全性问题一直是多方关注的焦点 ，特别像疯牛病这种 牛、鸡和混合血球蛋白粉为国家饲料检测中心武 普通热处理无法灭活的病原体 稠【更是需要严加监管 。 汉分中心送样；猪血球蛋白粉为上海杰隆生物制品有限 目前 。欧盟 已规定只有非反刍动物的血液产品才能用 公司提供；同时还在市场上抽检部分血球蛋白粉样品。 于饲料3[1。我国也先后出台了一系列法规和通知，禁止 1．2 仪器与试剂 违法进 口、经营和使用反刍动物及其产品、胚胎和反 梯度 PCR仪 (Biometra)、Sigmal一13离心机、电泳 刍动物源性饲料 。但随着蛋 白质饲料原料的紧缺和 仪 (Bio—Rad)、紫外分光光度计 (U一2001)、凝胶成像系 涨价 ，难免存在为了降低饲料成本 ，追求暴利 ，而使用 统 (Bio—Rad)。 牛、羊等反刍动物血粉的可能。因此 ，建立一种快速 、 DNeasyBloodTissueKit试剂盒 ，QIAquickGel 灵敏、可靠的动物血球蛋 白粉来源检测技术 ．对于提 ExtractionKit试剂盒，购 自Qiagen公 ；rTaq酶、dNTP、 高饲料原料安全性和制定相关饲料标准法规等具有 1kbMaker、10xbuffer均购 自大连宝生物工程有限公 重要意义 。 ‘ 司 ；鸡 、牛 、猪特异性 引物 (见表 1)，由Invitrogen公司 本试验采用单一动物线粒体特异性引物 ，对动物 合成。 表 1 引物序列及扩增片段长度 1．3 检测方法 DNA。用 U一2001型紫外分光光度计测定 DNA浓度 1．3．1 样品 DNA提取 1．3．2 PCR扩增 DNA的提取参考贺云霞等(2007)t~、罗家琴等f2008 50 l扩增体 系 ：10xPCR缓 冲液 5 l，dNTPs 的方法，简述为 ：鸡 、牛 、猪 、混合样品各取20mg,溶于 8tzl，TaqDNA聚合酶 0．5 l，模板 DNA猪 、牛、鸡分别 200Ixl的PBS中，加入 20 l的蛋 白酶 K，混匀 ，按照 为 5、5、1 l，上下游引物各 1 l，最后用双蒸水补足 DNeasyBloodTissue说 明书 中的操作 步 骤提 取 总 到 50 l。 PCR扩增条件 ：94℃预变性 3min，94oC40s． 60℃40S，72oC30S，30个循环 ，72℃延伸 7min 武艳军，扬州大学动物科学技术学院，225009，江苏省扬 1-3．3 PCR产物检测 州市扬州大学文汇路校区。 PCR扩增产物用 1％的琼脂糖凝胶 电泳检测 ，电 刘思国、陈建泉、马梓力、成 国祥(通讯作者)，上海杰隆生 压为80V，电泳时间30rain。电泳结束后 ，放人紫外 物工程股份有限公司。 凝胶成像系统观察 电泳结果并进行拍照 。用 OI—