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PCR 技术在乳酸菌分类鉴定中的应用 王庭柱，高学军，杨振宇 东北农业大学教育部乳品科学重点实验室（150030 ） E-mail：wangtingzhu1980@163.com 摘 要：近年来，随着分子生物学和生物信息学的迅速发展，特别是作为生物技术里程碑的 PCR技术以及核酸测序和电泳技术的不断改进与完善，产生了许多新的分类学方法，如 RAPD 、PCR-RFLP 、T-RFLP 、ARDRA 、PCR-SSCP 、PCR-DGGE 、PCR-TGGE 、AFLP 、 REP-PCR 、S-PCR 、LCR 、LH-PCR 、SBCS以及小卫星序列多态性和序列同源性分析等。本 文即论述了这些技术在乳酸菌分类鉴定中的应用及其优势和局限性。 关键词：乳酸菌，PCR ，分类，鉴定，分子生物学 1. 引 言 乳酸菌 （lactic acid bacteria, LAB ）是一大类缺乏细胞色素、糖代谢主要以乳酸为终产物 的革兰氏阳性非芽孢细菌，其过氧化氢酶反应为阴性、耐氧耐酸、营养要求复杂并且严格发 酵。LAB这个名称就细菌分类学而言实属一个非正式、非规范的名称。目前从自然界中已发 现的这类细菌在分类学上至少可划分为 23 个属，涉及到的有关菌种则更多 ，其代表性的菌 属有乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、气球菌属、肉 [1,2] 杆菌属、酒球菌属、足球菌属、四体球菌属和漫游球菌属等 。 传统的LAB鉴定方法主要依赖于表型分析，包括形态学观察、生长需要及特性、发酵图 谱、细胞壁蛋白分析、血清学以及脂肪酸甲基酯分析等，其中有些技术已被证明适用于某些 LAB 的鉴定，但是也普遍意识到表型分析的一些缺点，如重现率及辨识能力低、相似的表型 特性并不等同于相似的或者关系密切的基因型[3] 。表型试验可能的固有问题是，不是每一给 定种内的所有菌株都有一个共同的性状，而且即使是同一菌株也可能呈现出一定的生化变异 性。此外，实验操作的一点改变也可能产生错误的结果。因此基于表型试验的常规技术并不 能对菌株做出明确的鉴定[4] 。一般来讲，准确地鉴定一株乳酸菌至菌种的水平，至少需要 17 种表型实验[5]，但是微生态系统的分离株需要更为简单快速的鉴定方法。因此，需要进行表 型特性的分子水平研究和遗传特性的研究。 只有分子生物学技术才能解决LAB鉴定的复杂性。近年来发展起来的核酸技术如DNA 杂交和特定靶序列的扩增技术，对LAB 的鉴定是一种改进和补充。在LAB分类学方面，代表 性的遗传学方法是限制酶分析 （restriction enzyme analysis, REA ）的多态性 （如PFGE 、RFLP 和核糖分型）和PCR技术[3] 。REA是进行基因组DNA 的限制性内切酶消化。脉冲场凝胶电泳 （pulsed-field gel electrophoresis, PFGE ）是经酶切后，分离出大量的基因组片段；限制性片 段长度多态性 （restriction fragment length polymorphism, RFLP ）指的是酶切后含同源序列的 酶切片段在长度大小或数目上的差异；而核糖分型（Ribotyping ）是以rDNA和/或其间隔区 域作为探针，与基因组限制片段进行杂交。PFGE是菌株分类中最有识别力的方法，但是基 因组DNA 的所有限制片段的完全分离是个困难；迄今，最佳辨识力的遗传探针是种特异性 的[6] ；而PCR技术以及以PCR为基础的遗传指纹技术和群落分析技术甚至可以进行高度菌株 特异性的LAB鉴定。 PCR 技术的创立打开了 LAB 快速鉴定的大门，其不仅操作简便、快速可靠并且灵敏高 效，而且还克服了对培养的依赖性 （自然界中有 85～99.9% 的微生物至今还不能进行纯培 - 1 - 养）。PCR 技术用于 LAB 的鉴定和鉴别，一些是依赖于扩增子的多少有无，如特异性 PCR 、 多重 PCR 、PCR-RFLP 、ARDRA 、T-RFLP、RAPD 、