采用ＰＣＲ法与限制性内切酶分析对１２种分枝杆菌的鉴定.pdfVIP

中国人兽共患病杂志 Chinese ofZoonoses 178 Journal 采用PCR法和限制性内切酶分析 对12种分枝杆菌的鉴定 蔡宏1李淑霞1呼西旦1李君莲2武坚3张曼夫‘陈永福5 弱以及带型数量进行分枝杆菌苗神鉴定。通过对12种分枝杆菌的PCR反应和限制性酶切分析，可将被控标本中大部舟的分 技杆菌鉴定到种．本试验无需进行杂交或使用放射性物质，在24h即可完成。 关键词分技杆菌PCR限制性酶切分析 分枝杆菌是一种抗酸性杆菌，能引起人和动物 1材料和方法 致病和死亡。其中结核分枝杆菌复台群和禽一胞内 1．1实验材料 分枝杆菌复合群是主要的致病原，目前有关非结核 1．1．1菌种人结核分枝杆菌(TB)H37Ra，牛结 分枝杆菌的报道越来越多，约近百种，国际上公认的 核分枝杆菌(M．boris)，溃疡分枝杆菌(M． 有56种。从临床标本中分离出的致病性非结核分枝 杆菌包括堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌(或鸟型复 合分枝杆菌)．偶发分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、蟾分枝 chelonei 杆菌龟亚种(M sub劝．Chelonei)，偶发分枝 杆菌、海鱼分枝杆菌及龟分枝杆菌等7种。在美国和 欧洲一些国家，由于艾滋病患：苦和HIV感染者合并 感染非结核分枝杆菌和人型结核分枝杆菌，所以对 分枝杆菌的菌种鉴定显得极为重要。在临床上采用 品生物制品鉴定所。 生化鉴定方法对每种分枝杆菌进行i自型鉴定，该法 1．1．2生物制剂购自美国Promega公司产限制 一般获得结果可靠，但所需时间长；气相色谱薄层层 性内切酶。 析技术以及高压液相色谱对分枝杆菌的菌种鉴定方 1．1．3PCR引物由北京赛百盛生物工程公司合 法先进、可靠，但操作太复杂，所用仪器设备昂贵，仅 成。该引物分别位于65kDa蛋白基因序列398和 限于少数实验室使用o’2一。基因探针是一种快速、特 836碱基对处，序列如下： 异、敏感的鉴定方法，但鉴定的菌种范围有限o]。近 年来国外一些研究人员例如Kox等1995年以编码 16s 1．2实验方法 rRNA为模板，分别用特异性的针对不同分枝 rRNA1．2．1 细菌培养将标准菌株转移至研磨管中，加 杆菌探针对分枝杆菌基因中的一段编码16s 部分基因序列进行杂交，以_达到鉴定分枝杆菌的目 少许磷酸盐缓冲液用磨棒充分磨成悬液，转移至改 的[‘j。PetraDobner等1996年用16srRNA启动良的罗氏培养基37c培养4～8周。对临床病人痰 液结核杆菌分离是将痰液置4oANaOH溶液(含1蹦 区、16srRNA编码区序列、65kDa热激蛋白基因的 常用片段0．3kb对人结核分枝杆菌，戈氏分枝杆的N一乙酰～L～半胱胺酸)中混匀，室温静置 菌、蟾分枝杆菌等进行菌种鉴定比较[5]。本文采用了 作者单位：1．新疆膏牧科学院善医研兜所(乌鲁术齐，830000) Amalio Telenti等1993年报道的方法并略有改动， 2．新疆结棱病研究所 选择编码65kDa热激蛋白基因为PCR扩增模板， 3新疆畜牧科学院农业部畜牧兽医生袖搜束重点开放实 该蛋白存在于大部分的分枝杆菌中，其保守序列使 验室 得采用分枝杆菌通用引物进行PCR扩增＆产物的 4．中国农业大学生曲学院 酶切分析成为了可能-6J。