Icariside+Ⅱ诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的机制研究.pdfVIP

键灌 册婴焉嚣溢黑茹糕篡篇篓飘会麟隧2012海峡两岸tcsNR全国第10层中药及天然药物资源学术研讨会瀚量黑熏 亡涉及外源性通路的参与。因此，作为具有抗肿瘤活性的天然产物，Ic撕sideII值得进一步研究。 II 关键词生药学；凋亡；乳腺癌；Icariside 淫羊藿是一味应用历史悠久的传统中药，具有补肾阳、强筋骨和祛风湿的功效。中医常用淫 羊藿来治疗阳痿、遗精、不孕不育、绝经后骨质疏松症和风湿性关节炎等[1]。淫羊藿植物中活性较 强、研究较多的主要是8位有异戊烯基取代的黄酮类成分[2]。淫羊藿次苷II最初由MiZuno等从淫 羊藿地上部分分离得到【3]。研究表明：淫羊藿次苷II具有多种药理活性，包括抑制黑素生成[41、抑 制5型磷酸二酯酶活性‘51、保肝【61、抗骨质疏松‘刀、促进神经突触生长‘81、延长寿命‘91等。本课题组 最早报道了淫羊藿次苷II对肿瘤细胞的细胞毒活性[1们。近年来，其他研究者又相继报道了一些该 化合物抗癌活性的研究结果，例如：通过降低低氧诱导因子1a的蛋白水平诱导人骨肉瘤HOS细 断STAT3信号通路【l刘等。 MTT试验结果显示：淫羊藿次苷II呈剂量和时间依赖地抑制MDA—MB一231细胞增殖。据此， 开展本研究，以期阐明淫羊藿次苷II抗肿瘤的相关机制。流式细胞术检测发现：该化合物呈剂量 依赖地增加MDA—MB一231细胞亚G，期的比例，诱导细胞凋亡。于是，针对细胞凋亡的两条主要 信号通路，本文对该化合物的作用机制进行了系统深入的研究。 1材料与方法 1．1药品和试剂(略) 1．2Icariside II的配制方法(略) 1．3细胞培养(略) 1．4细胞毒性试验 采用MTT法检测Ic撕sideII的细胞毒活性。MDA—MB一23l细胞接种于96孔板，药物作用时 间为24，48，72，96和120 h，作用浓度为0，25，50，75和100uM。作用完成后，弃培养液， MTT的无血清DMEM，继续培养4 每孔加入100此含0．5mg／mL h，弃上清，每孔加入180肚DMSO m和570nm波长下测定光密度值(OD)，用以下公 溶解甲簪沉淀，振荡混匀，用酶标仪在450 式计算活细胞百分数，并按中效方程计算IC50值。 活细胞百分数(％)=(OD570—OD450)Icas／(OD570—OD450)co。仃oI×100％． 1．5 PI单染色和ArulexinV-FITC／PI双染色检测细胞凋亡 II作用72h，用不含 MDA—MB一231细胞接种于6孔板，分别以0，25，50，75uM的Ic撕side EDTA的胰酶消化并收集细胞，加入相应染色液，避光反应一定时间，过300目筛后上流式细胞仪 检测。 1．6 Westemblot检测Ic撕sideII对相关蛋白表达的影响 II处理72h， MDA—MB．231细胞接种于75mL培养瓶，分别以0，25，50，75灿I的Icariside h，4℃，12000 min，收集蛋白 消化并收集细胞，加入预冷RIPA裂解液，冰上裂解1．5 g离心20 上清，以Bradf．ord法测定蛋白含量，用裂解液将各样品调至相同浓度，加入5×SDS上样缓冲液混 匀，100℃金属浴煮沸10min变性后，取40岭进行SDS—PAGE电泳。 为检测IcarisideII对线粒体蛋白的影响，采用蔗糖．HEPES线粒体蛋白抽提液(蔗糖：250mM； HEPES：20 mM；EDTA：1mM；EGTA：1mM；DTT： mM，pH7-4；KCl：10mM；MgCl2：1．5 1 mM；PMSF：0．1 n1M；抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂：各l嵋／mL)提取线粒体蛋白。