动物源性大肠杆菌耐药性检测基因芯片的研制.pdfVIP

201 1544囝 o年学术年会 因芯片技术对其进行耐药性的确定。 1材料、试剂和仪器 了致病性大肠杆菌耐药株2l份。 Sci：芯片片基、杂交舱、杂交盖片均购自天津生物芯片公司。 powder-舶egloves，购自SF 1．3仪器Heatbloek(CHB．202liB．202)，杭州博日；Thermal ASP7201点样仪，PerKinElmer：GenePix 炉，UVP；Vl涨ELL55精密强制对流干燥箱，MMM。 2方法 耐药基因进行克隆及序列分析研究。 于40的序列。最后，探针的5 7氨基C3标记，加15个ploydT确定为最终的Oligo探针。将合成的寡 核苷酸探针溶于50％DMSO中，用微量加样器混合lO次，使得探针终浓度为30pmol／gl。 2．3点样样品将靶基因和定位对照基因定量至60 pmol，p，加入等量的基因芯片点样缓冲液配制成点 样液，靶基因和定位对照基因的使用浓度即为30pmol，p，将点样液按芯片设计要求加入96孔载样板 孔内。用基因芯片点样系统在氨基化基片上接触式点样。点样环境参数为相对湿度65～70％，温度20～ 25℃。芯片各样点中心间距为650 gm，样点直径为220pm。点制好的芯片静置于点样仪上充分干燥 过夜，然后用60～8012水合处理10S，立即于加热至80℃原位PCR仪上烘干，紫外线交联25min后， 以0．296SDS液洗涤5min，再以蒸馏水快速洗涤后离心干燥，密封、室温保存备用。 2．4杂交预热杂交炉到50℃，预热杂交液；取荧光标记样品，加入等体积的预热的2X杂交缓冲液， 混匀；95℃变性5min，最大速度离心2min冷却：在两个阵列上滴加样品液，加盖玻片，防止气泡的 lll 11 产生：在杂交槽中均匀加150 h：取标记产物和杂交液各8 MQ，并放上芯片和盖片，42℃水浴5 l混匀，点入芯片，并盖好盖，放入杂交炉中1．5h，50℃杂交。 4100扫芯片，以532姗波长进行扫描， 2．5寡核苷酸芯片杂交结果的检测及图象分析使用Genepix 扫描分辨率为10 3结果与分析 3．1大肠杆菌主要耐药基因阳性质粒测序分析 与GeneBank中发表的标准E．coli G_A。9、14、JXIl 突变。078R号菌株的GyrB基因，1308Tq。078R号菌株的AacC4基因，588 Leu_·Ⅱe11～1。 3．2芯片的点样过程的优化 温度、湿度对点样后矩阵的效果有较大的影响，湿度过低时，印记后的点小且不圆。使用加湿器对 其它动物疾病专题 o1545 点样仪的内环境加湿后，印记后的点有明显改善，点大小均匀且形状饱满圆润。最适点样条件为20℃， 湿度为70％。经实验得出探针的最佳浓度为30 中，使终浓度为30 pmol／gl。 3．3杂交效率的优化 通过对40℃～60℃等温度杂交后效果的比较发现，45℃，48℃均有非特异性点出现，而温度提 升至5l℃～60℃时非特异点消失，但是特异点在此温度区间内效果不好，经实验考虑42℃为最佳杂 交温度。确定5小时为最佳的杂交时间。 4讨论 探针分子的一端固定在芯片片基上，支持物对靶分子与探针分子的杂交形成空间阻碍，导致两者不 能理想的杂交。解决办法可通过提高靶分子的浓度来克服，还可以在较短的探针分子与支持物间加入适 当长度的连接臂，使固化的探针分子与支持物隔开一定距离，可减少空间阻碍。本实验在探针合成时， dT的连接臂13一。本实验所设计的寡核苷酸探针每列只有中央的一个 在探针的5’端连接上15个Poly 碱基是不同的，但并未检测A、G、C、T四