pNTAP-PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达.pdfVIP

中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2010，26(9)：1813—1817 · l8l3 · [文章编号] 1000-4718(2010}09～1813—05 pNTAP—PRAK真核表达载体 的构建及其在 HEK293细胞 中的表达水 王达安 ， 龚小卫 ， (南‘方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室 ，南方医院呼吸科 ，广东 广州510515； 暨南大学医学院病理生理学系，广东 广州510632) 刘 魏 [摘 要】 目的：构建 pNTAP—PRAK真核表达质粒，并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法：将人的 衅 PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandemaffinitypurification，TAP)载体 pNTAP质粒上，构建成重组质粒 pNTAP— 梅 邓 PRAK，转化该重组质粒至感受态大肠杆菌 DH50，【阳性克隆进行PCR、酶切及 DNA测序验证正确后，利用 PolyFect 脂质体介导将其转染至HEK293细胞中，再通过G418筛选建立稳定表达TAPtag—PRAK融合蛋白的HEK293细 计 胞系；利用 Westernblotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAPtag—PRAK的表达及细胞 内定位情况。结 果：重组真核表达载体构建正确，该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达 ，表达产物TAPtag—PRAK主要分布在 王 萎 核内。结论：成功构建pNTAP—PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系，TAP标签未对PRAK ●丹 定位产生明显影响。 ， △ [关键词] p38调节活化蛋白激酶；克隆，分子；基因表达 明 [中图分类号】 Q78 [文献标识码] A doi：10．3969／j．issn．1000—4718．2010．09．030 小 燕 Construction ofpNTAP -—PRAK eukaryoticexpression plasmid and its 王 expressioninHEK293cells 旭 WANG Da—all ，GONG Xiao—wei，LIU Ai—hua。 MEIZhu—zhong ，WANG Dan ‘ ， ， MINGXiao—yan ，WANGXu ，WEIJie，DENGPeng，JIANGYong (DepartmentofPathophysiologyandKeyLaboratoryforProteomicsofGuangdongProvince， DepartmentofRespiratory D e ，SouthernHospital，SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515，China；DepartmentofPathophysiology， MedicalCollege，JinanUniversity，Guangzhou510632，China．E—mail：fiang48231@163．com) [ABSTRACT] AIM：ToconstructpNTAP—PRAKeukaryotieexpressionplasmidandtoestablishastable HEK293celllineexpressingtandamaffinitypu