人IL-6+mRNA的实时定量检测法.pdfVIP

维普资讯 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2008，24(1)：206—208 [文章编号] 1000—4718(2008)01—02o6—03 · 实验技术 · 人 IL一6mRNA的实时定量检测法 邹立林 ， 郑晓群 ， 左江成 ， 王 震 ， 季敬璋 ， 吕建新 (温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室，浙江 温州 325035； 温州医学院附属第二医院检验科，浙江 温州 325027) [摘 要] 目的：建立TaqMan—MGB技术实时定量检测人 IL一6mRNA的方法，并用于检测人外周血单个 核细胞在牛膝多糖诱导下 IL一6mRNA的表达。方法：(1)抽取人外周静脉血，EDTA抗凝，用淋巴细胞分离液分离 外周血单个核细胞 ，用Trizol裂解液提取总RNA，将总 RNA逆转录为cDNA，PCR扩增 IL一6后纯化 PCR产物，与 pMD18一T载体进行连接，转化宿主菌 DH一5or。提取重组质粒 DNA，作为实时荧光定量检测的标准品。建立 TaqMan—MGB技术实时定量检测 IL一6mRNA的方法。(2)终浓度分别为0、100、200、400、800和 1600ms／L的牛 膝多糖作用于人外周血单个核细胞，定量检测 IL一6mRNA的表达。结果：(1)酶切分析、PCR扩增以及测序结果 均证实 IL一6cDNA成功重组到pMD18一T载体上。(2)TaqMan—MGB技术检测 IL一6mRNA线性范围广；灵敏 度高；特异性好；重复性好。(3)牛膝多糖作用于人外周血单个核细胞后IL一6mRNA表达增高。结论：TaqMan— MGB技术能较为精确地定量 IL一6mRNA。 [关键词] 白细胞介素6；RNA，信使；逆转录聚合酶链反应；TaqMan—MGB技术；牛膝多糖 [KEYWORDS] Interleukin一6；RNA，messenger；Reversetranscriptasepolymerasechainreaction；TagMan— MGBtechnology；Achyranthesbidentatapolysaccharides [中图分类号] R392．11 [文献标识码] A IL一6是由淋巴细胞 、单核巨噬细胞等产生的1种多功 量 PCR的引物及 TaqMna —MGB探针序列：上游引物5’一 能细胞因子，对免疫应答 、急性期反应、炎症反应 、造血系统 CCCACACAGACAGCCA(1TCA 一3’，下游 弓I物 5’一 GC- 和神经系统等有多方面的作用 0J。研究 IL一6的表达，对 CTCTTTGCTGCTTTCACAC一3’，TaqMan—MGB探针 ：5’一 于阐明某些疾病的发病机制 、诊断与治疗有着重要意义。检 CGGTACATCCTCGACGGCATCTCAG 一3’，PCR产物长度为 测 IL一6mRNA有定性和定量2种方式，定性检测法如斑点 129bp。引物及探针用 PrimerPremier5．0软件设计，由上海 杂交、逆转录一聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳法等，定 基康生物技术有限公司合成。 量检测法 目前主要采用TaqMan技术进行荧光定量PCR检 2 方法 测。研究 IL一6mRNA的表达，定量检测较定性检测有着更 2．1 人 IL一6mRNA实时定量检测标准的构建及鉴定 取 为重要的意义。本研究拟建立TaqMan—MGB技术实时定量 EDTA抗凝静脉血2mL，10mS／LLPS刺激培养4h。用淋巴 检测人 IL一6mRNA的方法，并用该法检测牛膝多糖对人外 细胞分离液密度梯度离心法 ，收集单个核细胞 ，用异硫氰酸 周血单个核细胞 IL一6mRNA表达的影响。 胍一酚一氯仿一步法提取总RNA。以寡核苷酸 (oligodT)为 引物，按常规方法进行逆转录。PCR扩增：50txLPCR反应体 材 料 和 方 法