非诺贝特对非酒精性脂肪肝大鼠脂质代谢和PPARα表达的影响.pdfVIP

400 华东地区第十二届实验动物科学学术交流会 粉10％、猪油7％、胆固醇2％，三号胆盐0．5％。 公司；胰岛素放免试剂盒(IMK414)购自中国原子能科学研究院，由杭州市第二人民医院完成盲样检测；非 诺贝特为江苏恩华药业集团有限公司产品，批蛋黄粉为浙江省长兴县艾格生物制品有限公司 Ribonucle．9．se 产品；胆固醇，三号胆盐购于华东医药股份有限公司；DNA聚合酶为Takara公司产品； LIFE BASIC公司产品，逆转录酶MMLV为Fermentas inhibitor(RB)为BIO 物由上海生物工程公司合成。TUNNEL细胞凋亡原位检测试剂盒为BIO．HIGHTECH公司产品。蛋白酶抑 提试剂购自武汉博士德公司。兔抗鼠PPAR CRUZ产品。 O【抗体，p-actin为SANTA 1．2方法 型组(12只)、③非诺贝特干预组(10只)。①组以基础饲料喂养，②、③组以高脂饲料喂养，自由进水 进食，观察动物一般情况，每周称体重。 ③组在高脂饲料喂养2周后，以非诺贝特非诺贝特(80mg／kg) 经口腔灌胃给药治疗，每天一次，连续10周。在高脂饮食4，8周后，从高脂模型组取1只动物作肝脏病 理切片观察。12周后，禁食12h，以乙醚麻醉大鼠，称重，腹主动脉采血，分离血清；迅速取出肝脏并称 重，计算肝脏指数(肝脏湿重／体重)；取最大叶肝脏用4％中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，作肝组织病理学 及细胞凋亡观察，其余肝脏．70。C冻存备用。 1．2．2血清相关指标的测定：GPT、GOT测定采用连续监测法； 具体操作按试剂盒说明书进行。 胰岛素抵抗指数=空腹血糖含量×空腹胰岛素含量／22．5。 1．2．3 PPARn表达水平的检测： RTPCR PPARⅡmRNA表达检测 RNAlgl，合成eDNA，以紫外线分光光度仪测定260、280nm的吸光度以估计样品量和纯度。PCR反应依 据Takara DNA聚合酶说明书进行，GAPDH为内参照，引物序列见表1，扩增条件为94℃5min预变性后， 94℃变性30S，52。C退火40 胶电泳，溴化乙键染色，用凝胶成像系统成像并摄片，用Bandscan软件进行图片分析。 PPAR Cc基因表达的强度=PPARa基因总灰度值／GAPDH基因总灰度值×100％。 华东地区第十二届实验动物科学学术交流会401 上游Forward5’．TGGTGCATTTGGGCG3AACTC．3’ 一… PPARⅡ 324 下嘉Reward5，一AcATGcGTGGAcTccArAGTG．3，． bp 上游Forward5’一ACCTCAACTACATGGTCTAC．3’ GAPDH 513 下嘉Reward5，一TTGTcATTGAGAGcAATGcc．3， bp Western blot蛋白定量检查冰浴中取大鼠肝脏组织，按l：10I：I：,tFUDH入预冷的裂解液，匀浆，40C静置 稀释各样品蛋白， 60。C 先后SDS．．聚丙烯酰胺凝胶电泳(10％的分离胶，5％的浓 30min变性，上样10}tl， 冲洗，化学发光显色系统显色。 免疫组化检查将中性甲醛固定的肝组织制成厚5um的石蜡切片，作免疫组织化学染色。选用sP法， 染色为细胞胞浆或胞核染成淡黄、棕黄或棕黑色。 1．2．4 液，室温孵育10min。封片，在光镜下分析结果，400倍视野下进行凋亡计数。根据凋亡细胞的形态特征判断 凋亡细胞：单个细胞，周围无炎症反应及坏死，胞质收缩，细胞核中有棕黄色颗粒或核