甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术.pdfVIP

尹惠琼，等：甲型HINl流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术 1 材料与方法 1．1主要材料及仪器 新甲型H1N1流感病毒核酸、HI-H16流感病毒核酸、季节性流感病毒、猪流感病毒等由 相关友好单位惠赠。引物、TaqMan荧光探针均由本实验室设计，其中引物由三博远志生物 剂为TaKaRa公司产品。17体外转录试剂为Promega公司产品。盲样由国家科技部组织提供。 iQ5Ⅲ多色实时PCR仪gJBIO．RAD公司产品。 1．2引物及TaqMan荧光探针设计 株HA基因序列。根据其突变位点设计用于HA基因检测的特异性引物和荧光探针。探针5、端 HEX标记，3’端BHQl标记。引物及探针序列如下： tca aat F：5-agtgag aga gga agggag g·3’ R：5-cct tot tatt-3’ tgggtg gacaagttg ata att aat ann Protm／TaqMan：5-HEX-accgag tgc cgc ggaaag tgc-ELIPSE一3’ 利用Blot在线软件嘲分析设计探针序列的特异性。 1．3检测程序 1．3．1病毒RNA制备 按TRIzol操作步骤按说明书提取季节性流感病毒、猪流感病毒RNA。 1．3．2荧光RT-PCR检测 RT·PCRBuffer12．5 Mix Ex 25pL反应体系：OneStep pL，Enzyme0．5肛L，TaKaRaTaqTM HS(5U／pL)0．5 pL，特异性引物各1．0肛L，TaqMan探针0．7pL，RNA样品2．0“L。 min，95C10 30 反应条件：42C7 sec；95Csec，53C20sec，40 Cycles，退火结束后 读取HEX荧光信号。 实验选用HA探针及其引物进行实验。 1．4RNA标准品制备 行二次PCR扩增，按1’7体外转录试剂盒使用说明书对纯化产物进行体外转录，酚：氯仿纯化， 紫外分析仪测定浓度后分装备用。 1．5特异性评价 利用建立的检测体系对新甲型H1N1流感病毒RNA、H1-H16流感病毒RNA、季：肯性流感 病毒RNA、猪流感病毒RNA等进行荧光RT-PCR检测，以验证其特异性。 1．6敏感性评价及定量分析 RNA标准品经10x系列稀释，利用建立的检测体系对不同浓度RNA标准品进行荧光 RT．PCR检测，以确定检测灵敏度。同时利用标准品检测扩增曲线获得标准曲线，对检测样 8 2010中日博JⅡ生自F}学}术论￡ r；^进仃定量分析 l 7重复性实验 复3砍，通过计算cl值得批问、批I^lCV％来确定榆删的重复性。 l 8样品检测 国家科技部提供的12份卣}￥包括不同稀释度的新笈甲Ⅱ岫INl流感痈母，以及季U性流 感病毒、禽流感病毒等其他流感病毒。实验对法亩样j』￡{?RNA提取后，各】投2MLRNA进行荧 光定带RT．PCR检测以验1m检测试剂的特异性及灵敏度。 2结果 2 1特异性分析及实验结果 选择j自毒核酸库进行BI，AST在线分析，比对结果显示，所吐计的HA荧光探针序列与新 源性最高选95％。 利川HA探针对杜J建的mj性质粒、季fl：“L感璃毒、猪流感病毒、H5N1’¨流感病毒及 HSN2型流感痛靠核酸进行，检测，结果HA探针特芹陆”+’j季1，性流感璃毒、猜流感病毒、 H5NIq”流感辅毒段HSN21【_l流感辆毒无交义反麻f结粜术显示)。 RNA进行荧光RT．PCR检测以评价其特异性．扩增结粜她削 新甲塑 一J—— 二{ 伊 ’『 __