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394 华东地区第十二届实验动物科学学术交流会
组以剖腹后仅翻动十二指肠后关腹；假手术组仅切开腹后翻动胰腺，以注射牛磺胆酸钠6d,时作为胰腺炎
模型。
1．2．2检测指标和检测方法
假手术组在手术完成即取血和胰腺组织，SAP组在注射牛磺胆酸钠后6小时血和胰腺组织，EN组在EN
后第12h、24h、48h为时间点取血和胰腺组织。采用Westernblot方法检测HMGBl组织蛋白表达，酶联
免疫吸附双抗夹心法(ELISA)检测血清7FNF—Q、HMGBl水平，按试剂盒说明进行操作。
胰腺组织TNF一Ⅱ、HMGBl
mRNA表达：取胰腺组织约80mg，以异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，采
用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测删TNF-(71、HMGBl
30
内对照。引物见表1，所用程序：94℃预变性4min，94℃30sec，退火温度见表1，72。Csec，30
u
个循环，最后于72。C再延伸10min。4℃终止反应。取51_PCR产物于1．5％琼脂糖凝胶电泳检测。溴乙锭
染色后于紫外透射仪摄像。
退火温 扩增长
基因 引物
度(℃) 度(bp)
SenCe 5’一ATGCCTGCAGCCC(；AGGGAAATCAAAAT一3’
TNF—o 58 680
Arlt．1 SenCe 5’ 一TTAGGACATTTCCTCCGAATGTATACTCTGATGTC一3’
SenCe 5’一ATGGGCAAAGGAGATCCTA一3’
HMGBl 61 680
Arlt．1 SenCe 5’ 一AATTcATcATcATCATcTTcT一3’
SenCe 5’ 一ATCTCTCGAGTAATGCCTGCAGCCCGAGGGA一3’
GAPDH 61 309
l ．1 ene 5’ ～ATCTGGTACCTTATTCAGGACCCCGGCGCTTTC3’
Ar t S C
blot)
1．2．3免疫印迹分析(Western
L
u 2×SDS蛋白裂解液裂解组织，将裂解液转移至
取100mg组织，用4。CPBS荡洗2次，加入100
Eppendorf管，超声10一15S，10000×g离一65
u min。样品经10％SDS一聚丙烯酰胺
定蛋白浓度。将20 g蛋白与2×SDS加样缓冲液混合，100。C煮沸5
凝胶电泳分离后，电转移法转移到硝酸纤维素膜上。室温下封闭4h后(封闭缓冲液：2％白蛋白溶于TBST，
h，
加入相应一抗，4。C过夜。洗去一抗后，加入辣根过氧化物酶偶联的相应二抗(1：i000稀释)，反应2
DAB显色。光密度扫描定量分析。
12．4统计学方法
13．0统计软件行单因素方差分析，P0．05表示具有统
实验数据以均数士标准差(x
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