新型猪细小病毒(PPV4)TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用.pdfVIP

病毒病一猪其他病毒病 殖与呼吸综合征病毒，猪瘟病毒，猪圆环病毒2型、猪细环病毒和猪源牛病毒性腹泻病毒均为阴性；批内及批间变 异系数均低于2％。用建立的荧光定量PcR方法对30l份临床病料感染情况进行检测，结果首次在我国猪群中检测 到PPv4，阳性率为3．32％，而普通PcR检出率仅为2．66％，且两种方法的符合率为loo％。结果表明，建立的检测 方法为PPw的检疫，分子流行病学调查以及敏感细胞的筛选等提供了新的快速检测技术． 关键词猪细小病毒4型；TaqMan荧光PcR；检测 PPV于1967年由 猪细小病毒(PPV)一直是危害猪群繁殖性能的主要传染性疾病之一。 Cam嘶蛳首次在不孕、流产、死胎母猪中分离到，并证实了其病原作用：引起猪繁殖障碍，除怀 孕母猪外，其他类型的猪感染后均无明显的临床症状。猪细小病毒还常和呼吸与繁殖障碍综合征病 毒(PRRSV)、圆环病毒(PcV)、伪狂犬病毒(PRV)混合感染，造成猪的繁殖障碍，给养猪业带来 霞人的经济损失。目lj{『研究认为，除r普通的PPV外，临床上还在多种PPV不同致病株和其他基因 型。 美国科学家存2009年新近检测到的新型细小病毒，该病毒基冈组基凶组约为5905bp，包含3个读码框 架。目前暂时将其归入细小病毒科(p口vDv们砌e)细小病毒亚科(砌M肮缸P)细小病毒属 仞口，．阳v砌s)HJ。国内除了普通猪细小病毒，PPVl的报道之外，其他二型均未有报道。因此，及时开 展PPV4的相关研究具有犀要的应用价值。 近年来广泛应用于临床病料检测的荧光PcR不仅具有灵敏性高、特异性强、用时短等优点，而 H．可以对枪测进行实时监控，检测结果直观准确。许多动物病毒都相继报道用Real．tiInePCR方法来 检测p嗡J。因此，本寅验在已公布的PPV4序列基础卜设汁引物和探针，通过优化反应体系和反应 条件，建立了基于TaqMan探针的猪细小病毒4型荧光定量PCR方法，并应用该方法检测广我国PPV4 流行情况，以及应用定量PC砌莲行了PPV4的部分敏感细胞的筛选上作。 1材料和方法 1．1毒株与阳性病料 市的猪群的发病猪临床病料，均由本实验室收集、分离、鉴定和保存。 1．2仪器和试剂 主要仪器有Eppendorf公司的Realplex4荧光定胃=PCR仪，ABI梯度VeritiPCR仪，Nanodrop DNA聚合酶 HS (DRR002B)； Taq 1．3引物和探针的设计合成 保守序列设计引物和TaqM肌探针，设计的卜游引物为5’．TGGTGGTC． AAGTATCTGTGCC．3’， 下游引物为5’．TTGCTTTTGGATGTCC．TGGT一3’，探针序列 1．4病毒DNA的提取 组织样品研磨液与血清样品反复冻融3次后离心吸，卜清液用于病毒核酸提取，采用天根公司的 病毒DNA提取试剂盒，病毒核酸的提取按照说明节进行。 1．5普通PCR反应 10×Bu虢r mMdNTPs PCR总体系为20HL，其中死g 2此，2．5 2此，上、下游引物(10“M)各0．5 min，95℃30S。 肛，砌gDNA聚合酶0．5肚，模板l此，余下用火菌ddH20补足。反应条件为95℃5 53℃30S，72℃15S，进行35个循环最后72℃延伸10min。反应结束后，产物于2％琼脂凝胶中电泳 鉴定。 第四次猪病学术研讨会会议论文集 1．6质粒标准阳性模板的制备 1．6．1 VP2基因的扩增 ， 2．5 mMdNTPs VP2F 缓冲液5止， 4此， LA．忍g酶5U，引物(10心D min后，95℃30s、60℃30s、72℃2lIlin