应用探针和影印技术筛选单独转化Ｌ－山梨糖生成２－ＫＧＡ的菌株.pdfVIP

其余培养基成分略。 固体培养基即在上述培养液中加入20／一2．5％的琼脂。 6．7～7．0，灭菌均为0．08MPa．25min。 以上培养基pH 3方法 3．1分离方法 It 士样加入无菌水，振荡，离心．取上清液经过滤器过滤(孔径2~5m，水样直接过滤)，以 除去悬浮物。特别是其中可能存在的原生动物。然后滤液经过合成培养基富集培养，采用双层 应阳性菌落于斜面上，编号，保藏，为初筛菌株。 3．2筛选方法 用分离得到的特征性初筛菌株点种于HB-HG影印平板上，筛选在HB平板上生长而在HG 平板上不生长的茵落，接种于HA种子液体摇瓶培养基中，摇床培养，用滴定法测2-KGA的产 量，进一步转接发酵培养基进行产酸测定，将产生2-KGA的菌株保藏，以供进一步的研究之用。 4结果和讨论 4．1锄分子探针的应用，极大地简化了利用卜山梨糖产2一酮基一￡一古嬲株的分离筛选过程 对于产2-KOA菌株的分离筛选，除通常的菌种筛选方法外，还应考虑到菌体利用相关碳源 产2-KGA的特性。所以在菌体筛选体系的确立上，着重点应在于能快速分离利用上．山梨糖产2． KGA的菌种。为此，在较深入研究了细菌产2-KGA的￡．山梨糖代谢途径后，而将SMA探针技 术引入筛选体系，从而很好的解决了这一问题。 SMA探针特异性的显示菌悻产生2-KGA的情况，从而示踪菌体利用三．山梨糖产2．酮基_上． 古龙酸的过程，所以在经过用有关碳水化台物为单一碳源的富集培养后，SMA探针技术可以快 速而准确地将2．酮基七一古龙酸产生菌从大量的细胞种群中分离出来。应用SMA探针技术，可 以从初筛平板上获得0．1--0：3％的SMA反应阳性菌落。SMA阴性菌落为非2．酮基也．古龙酸产生 菌，从而可以将大量的非2一酮基也一古龙酸产生菌淘汰掉，极大地简化了复筛操作，提高了效率。 4．2腿圆旧)—}IG影印技术，淘汰了能利用2一皓卜古龙酸的菌株，有效地挑选产2一酮基一卜古 龙酸的菌株，进一步提高了筛选过程的有效性 在通过初步筛选得到的SMA反应阳性菌株中，有一些菌株只是在发酵初期利用三．山梨糖产 2一酮基也．古龙酸；但在发酵后期又将2一酮基山古龙酸利用掉了；或2．酮基-工．古龙酸只是这些菌 板上不生长的菌落，从而将代谢终产物为2．酮基z．古龙酸的菌株真正筛选出来，进行进一步的 发酵验证。 4．32—酮基-1-古龙酸产生菌的获得 通过对103个土壤(水)样品进行分离筛选后，己获得多株产2．酮基吐．古龙酸的菌株，其中 J26、91．2、91-4等在HA培养基中显示了较高的产2一酮基也一古龙酸能力。 表1 J26、91—2、9卜4蕾株在眦培养基中2一酮基一}古龙酸的产量 从表I可以看出，J26、91—2、91—4均显示了较强的产酸能力，在HA培养基(宙2％￡．山 梨糖． w／w)中经过48h的培养，其摩尔转化率已分别达到39％、21．4％和234％，可初步认为 J26、91．2、91—4等菌株具有很高的产酸潜力。其中J26菌株所具有的产酸能力最高。 4．4新分离获得菌株产2～酮基一卜古龙酸能力的测定 经过多次的筛选和纯化，我们获得了J26、91．2以及91-4等菌株的纯培养。从SMB(或HB) 级种子培养液，经过18～24h培养，转接发酵培养基，测定2一酮基正一古龙酸的产量。经过培养基 组成的适当调整用HA专用培养基以后，发酵条件基本参考现行生产条件的情况下，通过10批 次发酵表明，J26产酸稳定，通过72h的发酵产酸量已可达到50--60mg／ml，其摩尔转化率平均为 66 4％(见表2)。 表2,126菌株发酵产古霓酸产量表 1 拉酵 2-KG^产量／雌·ml 发酵 2KGA产量／mg·ml‘ 批次 批次 1 68．69 6 43．89 2 63．14 7 6l’76 3 52．13 8 54．67 4