人参皂苷Rb1对高糖培养海马神经元胰岛素信号转导途径的影响.docVIP

人参皂苷Rb1对高糖培养海马神经元胰岛素信号转导途径的影响 　　[摘要] 目的：探讨人参皂苷Rb1对高糖培养SD大鼠海马神经元糖原合成激酶（GSK）3β/胰岛素降解酶（IDE）信号转导通路及β淀粉样蛋白（Aβ蛋白）分泌的影响。方法：原代培养新生24 h SD大鼠海马神经元分别接种在不同条件的培养基中，分为正常组、高糖组、氯化锂组以及Rb1组。上述培养基中培养72 h，Western blotting法检测其磷酸化GSK3β（pGSK3β）、总GSK3β（tGSK3β）和IDE蛋白的表达，RT-PCR法检测GSK3β，IDE mRNA的表达，ELISA法检测细胞上清液中Aβ蛋白的分泌。结果：与正常组相比，高糖组p/tGSK3β蛋白比值增加，IDE蛋白及mRNA减少，Aβ蛋白分泌增加（P0.05）；与高糖组相比，氯化锂组和Rb1组p/tGSK3β蛋白比值下降，IDE蛋白及mRNA表达增加，Aβ蛋白分泌减少（P0.05）；与氯化锂组相比，Rb1组p/tGSK3β蛋白，IDE蛋白及mRNA，Aβ蛋白分泌增加无明显差异；4组GSK3β mRNA的表达无明显差异。结论：人参皂苷Rb1可能通过减少GSK3β的磷酸化，下调pGSK3β/GSK3β的比值，上调IDE的表达，从而减少海马神经元Aβ蛋白的分泌。 　　[关键词]糖尿病；神经元；人参皂苷；Aβ；GSK3β；IDE 　　糖尿病与认知功能的关系越来越受到人们的重视。多项调查数据显示，与非糖尿病病人相比，2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）病人中阿尔茨海默病（AD）的患病率明显增加 [1-2]。Corinne G等[3]试验证明糖尿病存在胰岛素信号转导的异常及脑内Aβ蛋白（β-amyloid protein，Aβ蛋白）的沉积。Eric Steen等[4]研究发现AD患者存在胰岛素及胰岛素样生长因子的表达及信号转导的异常，从而提出AD作为“3型糖尿病”的概念。胰岛素信号转导异常造成的脑内Aβ蛋白的沉积可能为糖尿病认知功能障碍的发病机制之一。 　　药理研究发现人参皂苷Rb1可以上调神经因子的表达，促进神经元突触再生，增强胆碱能神经元抗损伤能力，对神经元具有保护及营养作用。本实验通过高糖条件原代培养海马神经元，探讨人参皂苷Rb1对高糖培养Sprague Dawley（SD）大鼠海马神经元糖原合成激酶（glycogen synthase kinase，GSK）3β/胰岛素降解酶（insulin degrading enzyme，IDE）信号转导通路及Aβ蛋白表达的影响。 　　1 材料 　　1.1 动物 新生24 h SPF级SD大鼠20只，体重约5～7 g，购自北京大学医学部，合格证号SCXK（京）2011-0012。 　　1.2 药物和试剂 人参皂苷Rb1购于中国食品药品检定研究院（货号110704，纯度大于99.1%），用前以DMEM培养基配制储存液；无水氯化锂购于美国Sigma公司（货号L4408，100 g，纯度99%），用前以DMEM培养基配制储存液；DMEM高糖培养基、优质胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA均购于北京协和细胞资源中心；多聚右旋赖氨酸（PDL）购于美国Sigma公司；兔抗鼠pGSK3β，tGSK3β，IDE多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司；Aβ42 ELISA试剂盒购于美国BD公司。 　　DMEM完全培养基的配制：DMEM高糖培养基（180 mL）中分别加入FBS（终浓度10%），Hepes（20 mmol?L-1），丙酮酸钠（1 mmol?L-1），双抗（青霉素100 U?mL-1，链霉素100 mg?L-1），谷氨酰胺（2 mmol?L-1），神经生长因子（nerve growth factor，NGF）（10 μg?L-1）。4 ℃冰箱保存备用。 　　1.3 仪器 3111CO2培养箱（美国Forma）；PK121R高速低温离心机（意大利ALC）；MultiSkan3酶标仪（美国Thermo）；IX71-A12FL倒置相差荧光显微镜（日本Olympus）；CKX31SF倒置相差显微镜（日本Olympus）；TCS SP2SE激光扫描共聚焦显微镜（日本LEICA）。 　　2 方法 　　2.1 海马神经元的分离、纯化与培养 具体步骤见文献[5]，最后接种于0.01%PDL包被的培养瓶或培养板中。 　　2.2 海马神经元的鉴定 以5×105个/孔的浓度将细胞接种到放有盖玻片的6孔培养板中培养，第3天取出盖玻片行神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）免疫荧光鉴定，激光共聚焦显微镜检测NSE的表达情况。具体步骤：用0.01 mol?L-1PBS浸洗盖玻片，后加入4