鸭胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建和鉴定.pdfVIP

中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会论文集 鸭胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定 胡桂学’，段小波，董 浩，饶桂波 (吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118) SMART技术，以LD—PCR合成 摘要：本研究将鸭胚成纤维细胞传代两次，提取细胞总RNA；利用Clontech cfu，插入的双链cDNA的平均大小为0．65Kb，文库的重 总RNA的0D舭I／OD2‰为2．0，文库容量达到5×106 组率为100％。该cDNA文库构建的成功，为筛选与小鹅瘟病毒结合的细胞蛋白奠定了基础。 关键词：小鹅瘟；鸭胚成纤维细胞；酵母双杂交；cDNA文库 成纤维细胞对小鹅瘟病毒敏感，是常用的研究鸭和 鹅细小病毒(gooseparvovirus，GPV)隶属细小 病毒科、细小病毒亚科、依赖病毒属，同属病毒还 鹅类病毒的细胞材料之一。其cDNA文库的构建对 寻找小鹅瘟病毒细胞受体的酵母双杂交系统有重要 有鸭细小病毒。GPV为单链线状DNA病毒，有2 的意义，为进一步筛选与GPVVPl蛋白相互作用的 个开放阅读框(ORF)，左侧编码非结构蛋白 (NS)，右侧编码结构蛋白VPl、VP2和VP3。VPl宿主蛋白奠定基础。 含有组成VP2、VP3的全部氨基酸序列。Vihinent” 等2002年开展了CPV致病机制研究，认为衣壳蛋 1_材料和方法 白VPl、VP2、VP3是决定病毒嗜性、宿主域和致 1．1材料11日龄鸭胚购自辽宁省某孵化场，cDNA 病性的关键因素，其中VPl可协助病毒或其DNA 2 通过核孔转运到细胞核内，可与宿主细胞膜的特殊 文库构建试剂盒、AdvantagePolymeraseMix购自 DNA聚合酶、DNAMarker、 受体结合，使病毒粒子进行有效感染。VPl蛋白在 美国Clontech公司，Taq 病毒侵袭细胞并产生感染方面起重要作用。因此， TRIzol、琼脂糖购自大连宝生物公司，胰酶、血清 VPl蛋白存在与细胞受体结合的病毒吸附蛋白(vi—购自Gibco公司，谷氨酰胺、碳酸氢钠、双抗、异 ralattachment VPl与敏感细胞 丙醇、氯、酒精等购机北京鼎国生物。文库鉴定引 protein，VAP)。GPV 的何种蛋白成分结合未见报道。 目前研究细胞受体的方法大多采用研究蛋白质 问相互作用的方法。酵母双杂交系统是一种检测蛋 白．蛋白相互作用的方法。该系统可在酵母细胞内 ．3’，由上海生物工程技术公司合成。 直接检测蛋白相互作用，能够有效的分离与一种已 1．2方法 知靶蛋白相互作用的蛋白质编码基因。由于蛋白质 1．2．1 鸭胚成纤维细胞的制备及小鹅瘟病毒的感染 是在酵母体内发生的相互作用，所以该方法的敏感 无菌操作将11日龄的鸭胚取出，按照张训海[4】、项 性很高，能检测到少量或微量蛋白问的相互作用【2，3】。 碧飞【5]提供的方法制备鸭胚成纤维细胞，分装至细 为了寻找小鹅瘟病毒的细胞受体，本实验利用酵母 胞瓶后，置于37℃，5％的CO：培养箱中培养。 双杂交系统寻找与GPVVPl结合的细胞成分。鸭胚 1．2．2鸭胚成纤雏细胞的传代及总鼢队的提取 领域国家科技计划(201 作者简介：胡桂学(1963一)，