人工伴侣条件下谷胱甘肽浓度对溶菌酶复性的影响.pdfVIP

维普资讯 第22卷 第2期 青 岛大 学 学报 (工 程 技 术 版 ) V01．22NO．2 2007年 6月 JOURNALOFQINGDAOUNIVERSITY (ET) Jun．2007 文章编号 ：1006—9798(2007)02—0078—06 人工伴侣条件下谷胱甘肽浓度对溶菌酶复性的影响 贾长虹 ，卢育红 (1．天津大学化工学院生物工程 系，天津 300072； 2．河北理．5-大学化工与生物技 术学院生物技术系，河北 唐山 063009) 摘要 ：利用盐酸胍变性 、二硫苏糖醇还原的溶菌酶为模型蛋白，考察人工伴侣一步法辅助 溶菌酶复性时的最佳谷胱甘肽浓度。结果表明，当复性体系 中溶菌酶浓度不同时，得到最 大复性收率的GSSG与 GSH 的浓度有所差异 。酶 的质量浓度在 0．06，0．1，0．2mg／mL 的条件下 ，随酶带入的还原型DTT的作用可以不予考虑 ，GSSG与GSH物质的量浓度 比 维持在 1：1时可以得到最大复性收率 ；酶的质量浓度在 0．6mg／mL的条件下，应当考虑 DTT的作用 ，此时，需将变化后的GSSG与 GSH物质的量浓度 比维持在 1：1时，才能得 到较大复性收率。 关键词 ：蛋 白质复性 ；溶菌酶 ；人工伴侣 ；谷胱甘肽 中图分类号 ：O609．73；O643．1 文献标识码 ：A 目前 ，DNA重组技术可以实现 4000多种蛋 白质的高效表达 ，但表达产物常常 以无活性的包含体形式 存在uj。蛋白质复性技术就是研究如何将包含体变为具有天然活性 的目标产物 。在这个过程中，首先要使 用变性剂将包含体溶解 ，使蛋白质形成松散肽链 ，然后利用各种方式促使肽链的再折叠 。蛋白质复性的方法 很多，人工伴侣系统辅助复性是其中的一种有效方法 。它是根据分子伴侣 的作用原理开发出来 的。典型的 人工伴侣系统是表面活性剂 (如 CTAB／~一环糊精 (p—CD))。其辅助复性的过程是通过 CTAB捕获伸展肽 链后 ，抑制肽链聚集 ，再用 p—CD剥离 CTAB，从而引发蛋白质折叠 ]。但这种通过上述两步完成的复性 过程 ，不可避免地增加操作步骤 ，加大生产成本。Heikki等 人将 CTAB加入变性液 中，在蛋 白质变性时实 现CTAB与伸展肽链的结合 (即人工伴侣一步法)，并证明此种做法与传统的两步法能够得到同样的效果 。 该方法可以提高产量 、降低稀释倍数 、减少单元操作步骤和操作体积 ，从而使加工成本费用降低 。但是 ，要使 这种方法得到广泛应用，必须对影响该过程的各类 因素进行研究 ，优化复性条件 。本文以盐酸胍变性 、二硫 苏糖醇还原、含有 4个二硫键的溶菌酶为模型蛋白，考察谷胱甘肽浓度对复性收率的影响 。 1 材料和方法 1．1 试剂 溶菌酶 、溶菌酶底物微球菌、盐酸胍 (GdmC1)、二硫苏糖醇 (DTT)、氧化型谷胱甘肽 (GSSG)、还原型谷 胱甘肽 (GSH)均购于 Sigma公司；三羟 甲基氨基 甲烷 (Tris)、二 乙胺 四乙酸钠 (EDTA)、十六烷基三 甲基溴 化胺 (cTAB)购于 Genwiev公司；其它试剂均为分析纯 。 1．2 溶菌酶的变性 将 15mg／mL溶菌酶溶液 (含有 30mmol／L的DTT，6mol／L的GdmC1，适量 的CTAB和 0．1mol／L Tris一硫酸，pH 8．5)置于 37℃，150r／min的摇床中反应 1h，使溶菌酶彻底变性和还原 ]。变性液 中加入 CTAB的量因复性体系中酶浓度不同而异。 收稿 日期 ：2006—11—25；修 回日期 ：2007—02—23 基金项 目：河北省教育厅资助项 目(2004107)；唐 山市科技局资助项 目(O42O45OLC一20) 作者简介 ：贾长虹(1966一)，女 ，副教授 ，辽宁省义县人 ，主要研究方向为蛋白质复性 。