猴小肠结肠炎耶尔森氏菌实时荧光PCR快速检测方法的建立.pdfVIP

三、大型实验动物饲养管理、质量控制、动物福利 589 疫局综合实验室保存。 安基因)。 1．1．3引物和探针根据小肠结肠炎耶尔森氏菌耐热肠毒素基因的保守区序列，设计实时荧光PCR引物 和探针【4】，上游引物：5’．AATGcTGTcTTCATl广rGGAGC．3，下游引物： 由大连宝生物公司合成。 1．2试验方法 1．2．1 基因扩增与PCR产物测序运用上下游引物引物对试验菌株目的基因进行两步法PCR扩增， 即95℃30s后，95℃5s，60℃34 结肠炎耶尔森氏菌进行基因比对。 1．2．2荧光PCR反应体系 gm01)0．4gl，下游引物(10 TaqMan荧光PCR反应液(2×)10pl，上游引物(10 gm01)0．4肛l，荧光 探针(10 I．tm01)O．8斗l，参比液ROX(50×)0．4}ll，超纯水2．0pl，DNA模板2．0|ll，总反应体积20pl。反 应参数：95C30s后，95℃5s，60℃34s，60。C处收集荧光信号，共40个循环。Ct值38判定为阳性， Ct值38判为阴性。 1．2．3DNA提取方法的比较传统酚氯仿抽提法：取100“I菌液，加入等量苯酚裂解，酚一氯仿萃取， 无永乙醇洗涤，用100肛l超纯水溶解即为DNA模板溶液。煮沸裂解法：取100p1菌液离心，沉淀用生理盐 000 水洗涤2次，最后用50pl裂解液悬浮，隔水煮沸15min，12r／rain离心5min，取上清液，即为DNA模板 溶液。磁珠提取法：取100 gl菌液洗涤离心，用裂解液裂解，加入结合液与磁珠混匀、静置，分离、洗涤 磁珠，用100 gl洗脱液洗脱，磁珠沉淀后上清即为DNA模板溶液。 1．2．4增菌试验 灭菌营养肉汤100倍稀释Ye菌液，分成两试管，一管立即-40C冷冻停止增殖，另一 管置37℃培养24h，同时取两试管菌液100pI用煮沸裂解法提取其菌体DNA，将所得的DNA用超纯水作10。1 至10。8稀释后进行荧光PCR检测，比较增菌前后的Ct值。 1．2．5特异性试验用煮沸裂解法分别提取非阳性菌株沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌和链球菌以及 阳性菌株小肠结肠炎耶尔森氏菌DNA，分别进行荧光PCR检测。 1．2．6敏感性试验用营养琼脂平皿划线纯化Y．e，挑取单个典型菌落于5llll的营养肉汤增菌12h，移取 0．5 h，取菌液作lO刁至10。10系列稀释，取每个稀释液0．1ml涂 Inl增菌液至50lTll新制营养肉汤中37℃培养12 布营养琼脂平皿，37℃培养24h后计数。剩余菌液立即移入-40C冰箱冷冻停止增殖。将经过计数的菌液稀 座标，细菌浓度对数为横座标作一曲线图。 行荧光定量PCR反应，重复三次试验，分析每次反应各浓度的Ct值的变异情况以检验该方法的重复性。 2结果 2．1普通PCI滞增及DNA测序 2．1．1 PCR产物电泳结果PCR扩增产物长度为145bp，见图1。 塑g一—三堕!盎塞墼星旦塾型煎型蜒型实堕叠塑生也幽究!i野谴皇_ 图l Ee菌PCR扩增结果 R∞ultofPCR on…Ⅲm Fig．m1 aroplificafion e”}ero∞tnT∞ M YePcRr增产物 。～ DNA*f质i标№(I¨如00)：卜3 M P_CR