氯丙嗪对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中国·南昌 第七届代表大会暨学术研讨会论文集 1引言 氯丙嗪是吩噻嗪类药物，在人医上主要用来治疗精神疾病，其在兽医上的药理作用也较广泛，主要被 用作镇静和抗应激剂。相关研究显示，氯丙嗪有抑制性周期、延迟排卵等作用【l】’在动物试验中，当给予 氯丙嗪后，发现动物出现卵巢，子宫重量降低，卵泡成熟受到抑制，子宫内膜开始萎缩，提示氯丙嚷可引起卵 巢功能降低【扪，能够对家畜繁殖及家禽产蛋产生不利影响。而颗粒细胞(Granulosacell，OC)是卵巢内的最大 细胞群，也是主要的功能细胞，卵泡发育的显著标志之一就是GC迅速生长及增殖，并可通过GC凋亡引起 成年动物的卵泡闭锁，此外，GC与卵泡膜细胞共同完成卵巢激素的合成，维着持有利于卵母细胞生长和成 熟的微环境，由此可见(论的增值、凋亡及激素分泌与卵泡的发育、卵母细胞的成熟密切相关【31。本试验以大 鼠体外培养的卵巢颗粒细胞为模型，观察氯丙嗪对颗粒细胞存活和凋亡的影响，以探讨氯丙嗪雌性生殖细 胞毒性作用机制，为氯丙嗪在兽医临床上的合理应用提供理论依据。 2材料与方法 2．1实验动物 2529 d龄未成熟雌性wistar大鼠，体重(80-220)g，清洁级，由湘雅医学院实验动物 中心提供。 2．2主要试剂 Hoechest 3328染液，普利莱基因技术公司；盐酸氯丙嗪，Sigma公司；RT-PCR试剂盒， Fermentas。 23方法 2．3．1大鼠卵巢颗粒细胞的分离、培养和染毒 每只大鼠一次性腹腔注射PMSG40IU，48h后颈椎脱臼处死，取出双侧卵巢，剪破有腔 卵泡，反复轻轻吹打使GC释放进入预冷的DMEM培养基中。200目不锈钢细胞筛过滤， 1000 min离心后，在含10％FBS(胎牛血清)的DMEM培养基中重悬并记数，台 rpm、10 盼蓝染色检测细胞活力，细胞活力95％，调整细胞密度为l×105／ml接种子培养板／lilt—瓴。 置于37℃、5％的C02细胞培养箱中培养。细胞贴壁后更换为去血清的DMEM培养液(含 1×10．8M的雄烯二酮和10 h，更换为含有氯丙嗪的培养液进 ng／ml的FSH)，继续培养24 行相关实验。 2．3．2IC50以及细胞活力的测定 采用M，丌法测定氯丙嗪对大鼠GC的IC50值，将所得的结果在EXCEL里进行曲线拟 合，最后计算出氯丙嗪的IC50值。据所得的IC50值，设置高、中、低三个浓度梯度的氯丙 嗪染毒组和阴性对照组，每组设置4个平行孔，于96孔板内染毒24h后用MTT法进行检 测，具体方法同上，并按如下公式计算细胞活力：相对细胞活力=(染毒组OD值尉照组 OD值)×100％。 2．3．3细胞凋亡率的检测 将接种于35IIlnl培养皿中的GC染毒24h后，吸尽培养液，按照普利莱公司Hoechest 中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中国·南昌 第七届代表大会暨学术研讨会论文集 33258细胞旖亡检测试剂盒说明操作，计算凋亡率。 2．3．4凋亡相关调控基因mRNA表达的半定量检测 除去上清后用Tfizol试剂盒一步法提取培养的颗粒细胞总RNA，以GADPH作为内参 照，用逆转录．聚合酶链式反应两步法检测氯丙嗪对培养细胞凋亡调控基因Bax、Bcl．2和P53 为变性、退火和延伸温度分别为94、55和72℃，反应时间均为30S，30次循环。扩增产物 在1．5％的琼脂糖凝胶中(含溴化乙锭)电泳，130V稳压20-30min，用凝胶图像分析仪 one4．4进行光密度(D)半定量分析，用目的基因与GADPH的光密度 摄片，并用quantity 比值代表mRNA相对表达水平。 表l 目的基因引物序列及片段长度 Tabl and Targetgeneprimerssequencesfragment