马立克氏病病毒诱导的鸡肝脏基因表达谱分析.pdfVIP

第二届全国禽病分子生物技术青年学者论坛论文集 words：Marek’SdiseasevirusChickenlivertissue Key Gene-ChipArrays 3．前言 引起的一种淋巴细胞增生性传染病，通常以外周神经和包括虹膜和皮肤在内的其他各种 器官和组织的单核细胞浸润为特征【11。MDV是少数几种能在自然宿主中诱导产生肿瘤的疱疹 病毒之一。MDV为肿瘤发生和发展的生物学、遗传学和免疫学等方面的研究提供了极好的动物病毒 模型。目前，基因芯片已广泛应用于基因组水平上分析摹因表达水平的差异，为研究肿瘤发生发展 中的基因开关及表达程度提供了强有力的工具。自从斯福坦大学的Schena和Brown等发表第一篇基 因表达谱芯片文章以来，国内外己将该技术应用于多种肿瘤及动物疾病的研究，如人类白血病、乳 腺癌【21、火鸡疱疹病毒13l等。尽管MDV诱导的鸡多种组织和器官的免疫相关基因和蛋白质组表达谱 的研究已有报导，但在非淋巴样内脏器官的研究报导较少，而且之前的研究主要是注重病毒复制感 染阶段而不是肿瘤形成阶段的相关基因表达谱模式。因此，本研究应用基因芯片技术，检测在肿瘤 形成阶段，MDV诱导的鸡肝脏组织相关基因表达模式，期望能从中筛选出在肿瘤发生发展过程中起 关键性调控作用的基冈，揭示其基因转录水平的本质，为研究MDV诱导的肿瘤发生发展的分子机 制提供一定的基础依据。 2材料与方法 2．1病毒与实验动物 free I型MDV标准强毒株Jing-1株由中山大学生命科学学院曹永长教授惠赠。Specificpathogen (SPF)白来航鸡购于广东新兴大华农禽蛋有限公司SPF实验动物中心． 2．2主要试剂 TRIZOL I和RNase reagent、DNase FirstStrandcDNA SYBRGreen Kit购自加拿大MBI公司，FastStart Synthesis Master(Rox)购于瑞士 Roche公司。 2．3动物感染试验 30只5日龄SPF自来航鸡随机分成两组，其中实验组20只，对照组10只。实验组SPF鸡腹腔 接种MDV PFU／只：对照组接种等量的灭菌生理盐水。两组SPF鸡在 Jing-l毒株，接种剂量为2×103 负压隔离器中饲养，并自由采食．在接种后的第在第35天，分别从两组中随机选择3只鸡，采集肝 脏，并贮存于．70℃备用。 2．4总RNA的抽提 按照TRIZOL reagent的说明书进行肝脏组织总RNA的抽提，所得的总RNA用DNaseI消化 基因组DNA，然后在Eppendorf 在1．O％的琼脂糖凝胶一卜电泳，检测RNA的质量，总RNA存于．70℃待用。 2．5基因芯片实验 羊二月仝目禽#》}i*拄$青年擘者论括论i集 分别选取MDV攻毒实验组和空白对照组各三个生物学重复，将它们对应的肝脏组织保意RNA 2．6实时荧光定量RT-FCR对基因甚片结果的验证 FirstStrand 样品RNA的采用RevertAidTM 为模板，GAPDH基因为内参，进行实时荧光定量RT-FCR反应验证随机选择的15个差异表达基因， 差异表选基因与内参基因的。值，利用2也66公式计算所选择的差异衰达基因的相对表达量。并与 基因芯片的结果进行比较． 3结果 3l总RNA的提取结果 所有实验肝脏样品用TRIZOL法提取总RNA后．进行定性、定量检测．各样品总RNA的 实验。 1 2 3 4 5 6 嗤lRNA琼脂糖电泳 Fi91．RNAagaroseebdⅫ∞bM酬s 3．2基因荔片筛选结果 利用SAM软件对芯片数据进行了差异基因的符选．弗得到269个差