茵陈蒿汤对肝内胆汁淤积湿热证大鼠BSEP表达的影响.pdfVIP

按200mg／l【g的剂量一次性灌胃，诱发大鼠急性肝内胆汁淤积病变。 1．4药物制备： 次，第1次45rain，第2次30min，取两次煎煮液浓缩至550mL，每mL含生药量lg。 1．5干预方法： 茵陈蒿汤组：造模第8天开始每天下午给100％茵陈蒿汤2mL／1009灌胃，一直到造模结束后 28天，共用药42天。 正常对照组和模型组都予0．9％生理盐水2mL／1009灌胃。 1．6标本的采集及保存 肝组织标本：各组随机选取8只大鼠采血时取肝，经门静脉灌注0．9％生理盐水冲去血液．将 所取肝组织标本分成两部分：一部分固定于4％多聚甲醛溶液中，石蜡包埋，行病理切片常规苏木 精一伊红染色检查，显微镜观察肝脏组织结构变化；另一部分快速放入冻存管，液氮冷冻后，置．80℃ 冰箱保存、备用。 1．7 BSEP基因表达水平测定 plus艾本德核酸蛋白测定仪上测定OD值，进行总RNA的纯度检测：用凝胶成像系统观察总RNA 的5srRNA，18s rRNA和28srRNA条带，进行总RNA的完整性检测。 37℃反应lh，然后95℃3rain。 DNA多聚酶、dNTPs 阳性标准模板的制备：取逆转录反应产物cDNA5ul，加入上下游引物、Taq Gel 等，PCR仪中变性、退火、延伸lmin。琼脂糖凝胶电泳，割下目的条带，回收试剂盒(QIAauick Extraction Kit)回收纯化。紫外分光光度计上测定，根据OD260测定值和片段长度数据换算出浓度 (copy／u1)，做梯度稀释，制备成阳性定量标准品梯度。 荧光定量RT-PCR测定：不同浓度阳性定量标准品及待测样本的cDNA5ul，加入上下游引物、 荧光探针、TaqDNA多聚酶、dNTPs等，荧光定量PCR仪中变性、退火、延伸。反应结束后，荧 光定量PCR仪自动分析并计算结果。 检测序列片段大小： 内参基因：18SrRNA．1 12bp： 目的基因：BESP．174bp(GenelD：83569)； 引物序列： 1．8观测指标 观察模型动物的症状，如：纳呆、便溏、倦怠，饮水量，饮食量，体重，肛温。每组随机选取 8只取血，采用全自动生化仪检测各组大鼠的胆红素及肝功能，观察肝脏组织病理变化．荧光定量 RT-PCR法在mRNA水平上检测BSEP的表达。 1．9统计学分析 行正态分布检验、方差齐性检验；在此基础上运用One-way ANOVA) AnalysisOfVariance(One-way ·330· T2法，P0．05为有统计 进行各组间方差分析，方差齐同时用Scheffe法，方差不齐时用TambaneS 学意义．检验水准为a=0．05(双侧)． 2结果 2．1一般情况 湿热证造模阶段：湿热证造模大鼠第4天后即出现眯眼，喜扎堆，成群蜷卧，弓背神萎，轻微 耸毛，活动量减少，饮食、饮水减少，被毛松散，无泽晦滞，便粘滞条状稀便，体重有所下降，肛 温升高，符合湿热证改变特点。正常组大鼠活动、饮食、大便及精神状态均正常。 黄疸造模阶段：正常组大鼠活力充沛，毛发柔顺有光泽，尿色清亮。灌服ANIT后的造模大鼠， 表现为精神萎靡、易激惹，毛发凌乱失去光泽，耳背皮毛稍黄，活动量减少，食欲减退，尿液深黄。 2．2肝脏组织病理学观察 正常组大鼠肝脏外观轮廓、颜色正常；肝组织切片镜下观察，肝脏肝索排列规则，呈放射状， 肝小叶清楚。中央静脉、汇管区结构正常，未见肝实质细胞病变。模型组大鼠肝脏外观较肿胀；肝 组织病理切片镜检可见中央静脉充血明显，肝索排列不规则，肝脏细胞肿胀变性，可见点状坏死， 肝窦受压不规则，小叶问有单核细胞和淋巴细胞浸润，汇管区胆管增生，周围带出现胆盐淤积，符 合肝内胆汁瘀积性黄疸的改变。茵陈蒿汤组干预后未见明显肝细胞坏死，肝脏中央静脉稍有充血， 未见明显胆管增生及胆