应用慢病毒载体介导RNA干扰(RNAi)技术动态研究不同发育期雌鼠下丘脑NELL2与GnRH基因及性发育的关系.pdfVIP

资料汇编 2011年第11届中华医学会儿科学分会内分泌遗传代谢学组学术会议 基因表达，动态的研究不同性发育阶段雌鼠NELL2mRNA、蛋白表达变化，以及 其对GnRHmRNA表达和阴门开启时间的影响。初步探讨NELL2调控GnRH神经元 进而参与性发育启动的可能机制。 方法针对大鼠NELL2基因，构建NELL2真核表达载体和4对microRNA干扰质 mRNA 粒，分别共转染HEK293细胞，实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检；!贝IJNELL2 的表达情况，筛选出其中1对干扰效率最高的microRNA，通过重组方法构建慢病 毒干扰载体并包装成慢病毒。对幼年期(21日龄)SD雌鼠侧脑室分别注射生理盐 干扰病毒载体(干扰病毒组，V-miR，30只)，注射后各处理组再随机平均分为3 组(每组10只)，分别于30日龄、35日龄及45日龄时处死。观察并记录大鼠阴门 mRNA 开启时间。提取下丘脑组织，采用Real-timePCR方法检测下丘脑NELL2、GnRH 的表达，Westernblot检测NELL2蛋白表达。 结果 病毒干扰载体并包装成慢病毒，病毒滴度为1×109IJT／ml。(2)与对照组(盐水 对照或病毒对照组)相比，30日龄、35日龄及45日龄干扰病毒组NELL2基因和 蛋白表达水平均明显下降(P0．Ol或PO．05)。说明本研究构建的慢病毒干扰载 体在体内能够持续、高效的抑制NELL2基因的表达。(3)30日龄、35日龄干扰 病毒组GnRH基因mRNA表达显著下降(与同时间点对照组比较分别为PO．Ol和 响青春启动前期及发育早期GnRHmRNA的表达水平。(4)实验过程中观察各组雌 鼠阴门开启时间，结果干扰病毒组阴门开启时间与对照组相比明显延迟 (PO．01)。说明NELL2可以影响大鼠性发育启动。具体数据见附表1-4。 结论 (1)慢病毒介导RNAi技术在体内能够有效抑制NELL2基因的表达，进 一步抑制GnRH基因表达，此方法为靶向体内性发育的控制及性早熟等疾病的防 治提供了有力的依据。(2)NELL2可以影响GnRH的基因表达，其机制可能是通 过影响GnRH 可以延迟大鼠性发育。 (图表略) 25l 应用慢病毒载体介导RNA干扰(RNAi)技术动态研究不同发育期 雌鼠下丘脑NELL2与GnRH基因及性发育的关系 作者： 周莎莎， 李嫔 作者单位： 上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院 200040 引用本文格式：周莎莎.李嫔 应用慢病毒载体介导RNA干扰(RNAi)技术动态研究不同发育期雌鼠下丘脑NELL2与 GnRH基因及性发育的关系 [会议论文] 2011