高效液相法测定缺血时小鼠脑组织中ATPADP和AMP含量的变化.pdfVIP

中国老年学杂志/990124 中国老年学杂志 CHINESE UOURNAL OF GERONTOLOGY 1999年　第19卷 第1期 Vol.19 No.1 1999 高效液相法测定缺血时小鼠脑组 织中ATP、ADP和AMP含量的变化 马丽焱　肖培根　张曙明　张　琪　王春兰　陈建民　 　　摘　要　本实验采用高效液相法、乙腈磷酸缓冲液作为流动相、紫外检测 (254nm)、在ODS柱上成功地分离并测定了小鼠脑组织中APT、ADP和AMP的含量。方 法简便、灵敏，重复性好。比较正常以及缺血条件下脑组织中高能磷酸化合物含量的 变化，结果发现60 s内随着缺血时间延长，ATP减少，AMP增加，ADP呈双相变化。 　　关键词　高效液相法　磷酸腺苷　脑缺血 　　缺血性卒中时首先出现的是组织缺血引起的能量代谢障碍，因而提高局部血流 量，改善能量代谢无疑将有助于减少操作，促进局部组织功能恢复。观测小鼠全脑缺 血后喘息持续时间的变化，是筛选抗脑缺血性损伤药物的经典方法之一。但是该法比 较粗糙，缺乏准确性。液相色谱法是目前应用范围最广、最常用的一种分析方法。本 文采用高效液相色谱法测定断头引起的完全性脑缺血不同时间内小鼠脑组织中ATP、 ADP和AMP含量的变化，旨在为筛选抗脑缺血性损伤药物提供一种快速、精确、简便 的检测方法。 1　材料与方法 TM 1.1　材料　HPLC 600泵、486多波长紫外检测器、Millennium2010软件系统：Waters 〔1〕 1.2　色谱条件 　参照文献并加以改进。流动相A：150 mmol/L KHPO +150 mmol/ 2 4 L KCl，用2 mol/L KOH调pH至6.0；流动相B：85%A相+15%乙腈。实验当天流动相经孔 充入氦气持续脱气。柱温为室温(14～18 ℃)检测波长254 nm；检测灵敏度1 AUFS。进 样量5～25 μl。ATP、ADP和AMP的理论塔板数分别为5 213、9 493和20 177。 ml，0.3 mol/L HClO 4 ℃待测定。 〔2〕 1.4　蛋白含量测定　考马斯亮兰法 ，以牛血清白蛋白为标准。 file:///E|/qk/zglnxzz/zgln99/zgln9901/990124.htm（第 1／4 页）2010-3-23 16:00:02 中国老年学杂志/990124 2　结　果 -3 2.1　标准曲线　分别称取ATP、ADP和AMP标准品，用蒸馏水配成10×10 mol/L的母 液，1∶100稀释后取5，10，15，20，25 μl进样，并根据进样量和测得的峰面积求取回 归方程及相关系数。 　　结果表明ATP、ADP和AMP进样量与峰面积呈良好的线性关系，所得直线方程分 6 5 4 x，r=0.999 7；ADP：y=7.227×10x+5.753×10，r=0.999 7； 别为ATP：y=1.085×10 5 4 x+5.940×10，r=0.999 3。三种标准腺苷酸分离较完全，分辨率＞ AMP：y=7.571×10 1.5。 〔3，4〕 2.2　回收试验和重复性试验 　组织中加入一定量的标准品，经过沉淀蛋白、中 和酸性等步骤，测定腺苷酸类物含量，与取自同一组织同批处理的样品比较，计算标 准品的回收率。结果见表1。