毕赤酵母表达系统的应用研究.pdfVIP

刘春凤 在 DNA体外重组和异源表达技术中．酵母表 最 先发展 了 以甲基 营养型酵 母 (methylotrophic 达系统是重要的一个组成部分。对于它的优势，大 yeast)为代表的第二代酵母表达系统。其中毕赤酵 量中外文献用实例证明 用综述总结 酵母菌是最 母 (p．pastoris)是继 S．cerevisiae之后被迅速推广的 简单的真核模式生物，兼有原核、真核两种表达系 一 种外源基因表达的宿主菌。 统的优点： P．pastoris表达异源蛋 白的应用 ．主要从上游 1．全基因组测序完成 ．基 因表达调控 的机制比 设计、表述和纯化三个模块进行阐述。 较清楚，遗传操作相对简便 ： 上游设计 2．生长繁殖速度迅速．能够耐受较高的流体静 外源蛋白表达前的分析是相当重要的．好 的开 压 ．类似于原核生物的快速繁殖并能达到很高的浓 始是成功的一半 ．在上游设计 中人为控制的因素比 度 (130g干物质 ／L培养基)： 较多．要做足准备功课 蛋白质高级结构是由其一 3．有完整的亚细胞结构和类似于高等真核生 级结构即氨基酸序列所决定的．确定重组蛋白的氨 物的控制严密的基因表达调控机制 ．具有原核生物 基酸序列是第一步 ．氨基酸序列由mRNA序列编 所不具备的蛋白质翻译后的加工和修饰功能．如信 码 ．但由于遗传密码的简并性．mlKNA的编码序列 号肽剪切、糖基化、蛋白的折叠、二硫键的形成等 ， 与相应的氨基酸并非一一对应关系．而是多对一的 性质较原核表达的蛋白质更加稳定 ．表达 的外源蛋 关系。因此，核酸编码序列包含比氨基酸序列更多 白与天然蛋白相似 。抗原性低 ．有利于应用 ，特别适 的信息。基因的最佳化表达可以通过对基因的重新 合于表达真核生物基因和制备有功能的蛋白质 ： 设计和合成来实现 有很多很好的软件和在线设计 4．某些酵母表达系统具有外分泌信号序列 ．能 软件根据 目的蛋 白的氨基酸序列．给予合适的参数 够将所表达的外源蛋 白质分泌到细胞外．因此相对 就可以自动给出该蛋白的优化核酸序列 但单个软 利于后续的纯化 ： 件都会有其长处和短处．最好的办法是使用多个优 5．不存在原核表达系统难 以除去的内毒素 ．也 化软件分别进行优化 切莫只依靠单一的软件优化 不存在哺乳动物细胞表达系统的特异性病毒和支 结果。 原体污染等 ．对人体和环境较安全 翻译效率在蛋 白生产和积累中起着重要作用。 自然界中酵母种类繁多．目前被开发出来用于 翻译过程分为起始、延伸和终止三个期。对于翻译 表达外源基 因的只是极少数 酿酒酵母 (Saccha— 的起始，在真核细胞，有效的起始依赖于围绕在起 romyces．Cerevisiae)在分子遗传学方面被人们的认 始密码子 ATG上下游的一段叫Kozak的序列 如 识最早，也是最先作为外源基因表达 的酵母宿主 。 果用的是载体上的信号肽 ．只要保证阅读框正确就 但由于酿酒酵母的局限．1983年美 国Wegner等人 可。密码子利用或偏爱对延伸有深刻的影响 目的 蛋 白基 因使用的密码子可能不是你所选择的蛋白 主系统．更要注意二者最佳匹配的问题。当然如果 生产系统进行高水平表达所偏爱的密码子 ．这种情