乙肝病毒X基因对肝癌细胞Bel-7402+RelA蛋白表达的影响.pdfVIP

HBx蛋白是一种反式作用因子，虽不能直接与DNA结合，但可以与细胞内多种与转录、基因调 控有关的细胞因子结合，广泛激活病毒与细胞的启动子。促进病毒的复制和宿主细胞的基因转录． 参与体调节基因的表达。HBx蛋白可能通过与多种转录激活因子发生相互作用，反式激活癌基因的 转录活性而最终导致肝细胞的恶性转化¨1。 目前认为HBx可能诱导RelA表达并通过RelA发挥抗凋亡作用。RelA是NF—KB家族的重要成 员，具有抗凋亡促增殖和促肿瘤生成的作用…。已有研究发现，在HBV相关的HCC组织中RelA的 表达有上调现象…，此种上调是否与HBx的诱导有关并不清楚。因此，本研究主要观察HBx对RelA 表达水平的影响，为进一步探究HBx如何诱导RelA异常激活的机制奠定基础，以探讨HBx是如何 通过RelA诱导HCC的分子机制。 本研究通过脂质体转染法将带有HBx基因的真核表达载体导入Bel一7402肝癌细胞，通过细胞总 蛋白提取、聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblotting检测转染后细胞中ReLA表达量的变化，初步研究 HBx对病毒性肝癌细胞中RelA的影响。 ’ 1．材料和方法 1．1．材料 Cruz公司。 马抗兔和马抗小鼠IgG抗体购于美国Santa 1．2．方法 1．2．1．细胞培养 的条件下连续培养。在倒置显微镜下观察细胞形态。转染前24小时，用胰酶消化以便收获对数生长 染。 l，2．2．载体构建及瞬时转染 I和XhoI酶切位点的引物，扩增长度为482 设计含有EcoR bp的HBx基因片段，经酶切和连接 用脂质体转染法将构建成功的pcDNA3．1一HBx瞬时转染Bel一7402。 1．2．3．细胞总蛋白提取 分别用PBS磷酸盐缓冲液漂洗并收集转染后培养48小时后的Bel一7402，3000rps／min离心5 ulPMSF(事先混匀)，冰上静置裂解30min，12000rps min，弃上清，加入40ul细胞裂解液及0．4 离心10min收集上清，用改良的Bradford法进行蛋白定量．一80℃保存备用。 1．2．4．Western blotting min。上样至15％SDS一聚丙烯酰胺 根据蛋白浓度每孔上样60斗g蛋白，加入上样缓冲液煮沸5 min。4oC加V转 凝胶中，80V电泳30min后，120V电泳60min。取出凝胶。于转印液中平衡30 印3小时至PVDF膜。取出PVDF膜，l×PBS漂洗5min，室温封闭2小时。应用特异性兔抗人RelA 抗体(1：1000稀释，Santa Cruz．USA) 为一抗杂交过夜，分别用马抗兔和马抗小鼠的二抗杂交2小时。应用DAB显色法显色并扫描成像。 以B-actin为内对照。比较转染HBx培养48小时后的细胞中RelA蛋白表达水平的变化。 40 2．结果 1 HBx鉴定结果 2】真接表达载体pcDNA3 l和Xho 1-HBx重组表达载体．设计含有EcoRI酶切位点的引物．扩 插^肋zY基因的pcDNA3 增长度为482 h的HBx基田片段．缝酶切和连接反应将HBx片段插入peDNA31戟体中，构建重组 电泳椅测出现483砷的HBX片段，说明构建成功。 圈1 1一HBx质粒ECORI和XhoI双酶切鉴定电泳围 pcDNA3 1泳道：DNAmrker；2泳道：质粒酶切片段；3被道为未酶切的质粒。 2．2 RelA蛋白W畔tem blotting检测结果 应用Westem 的变化。结果如图2所示．