马腺疫链球菌 FNE 基因的克隆及原核表达.pdfVIP

动物医学进展 ，2014，35(12)：27-31 ProgressinVeterinaryM edicine 马腺疫链球菌 FNE基 因的克隆及原核表达 徐全圆，刘建华，苏 艳 ，加 尔肯，王世民，冉多 良 (新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052) 摘 要：采用PCR方法从马腺疫链球菌新疆分离株 中扩增 FNE基 因片段 ，克隆至 pMD19一T载体。利 用分子生物学软件分析测序结果 ，将 FNE截短基 因亚克隆至原核表达载体 pET一30a中，转化到大肠埃希菌 (E．coli)BL21(DE3)感受态细胞 ，以IPTG诱导 FNE重组蛋 白的表达 ，用SDS_PAGE和 Westernblot法分 析蛋 白表达 及 其反 应 原性 。序 列分 析 显示 ，其与 GenBank收 录 的马 腺 疫链球 菌 4047(登 录号 YP002747216)核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为99 。采用PCR法扩增到 675bp的FNE截短基 因片 段构建重组表达载体获得重组蛋 白，经sDS分析在46ku处 出现明显条带，Westernblot分析显示具 有反应原性。成功克隆和表达 了马腺疫链球菌的FNE截短基 因，为重组 FNE蛋白亚单位疫苗的研制奠定 了基础 。 关键词：马腺疫链球 菌；FNE基 因；序列分析 ；原核表达 中图分类号 ：$852．611 文献标识码 ：A 文章编号 i1007—5038(2014)12—0027—05 马腺疫是 由马链球菌马亚种引起动物发热、上 白Marker购 自北京全式金生物技术有限公司；蛋 白 呼吸道黏膜发炎 、下颌淋 巴结肿胀化脓为特征 的急 预染 Marker购 自天根生物有 限公司；HRP标记的 性接触性传染病 [1]，马链球菌马亚种又名马腺疫链 兔抗马二抗购 自美 国BETHYL公司；马腺疫链球 球菌 ，为链球菌属 C群成员_2]。在侵袭宿主时先是 菌新疆分离株 、原核表达载体 pET-30a、一抗为新疆 通过纤黏蛋 白结合蛋 白(fibronectin，FN)黏 附到宿 伊犁地区发生马腺疫 的阳性马血清 由新疆农业大学 主细胞上_3]，由于马链球菌表面具有透 明质酸荚膜 ， 动物医学学院传染病实验室保存 ；其他试剂均为国 抗吞噬类M 蛋白 ]，与分泌的一些外毒素共 同作用 产分析纯 。 来逃避机体的吞噬_5]。纤黏蛋白结合蛋白能够与机 1．2 方法 体 内的纤黏蛋 白相结合 ]，有助于病原菌在机体 内 1．2．1 引物的设计与合成 参考 GenBank上 已发 表的FNE的基因序列 (AF360373)，设计一对引物： 的侵袭及扩散 。现 已报道的马腺疫链球菌纤维蛋 白 FNE—L一1：5一GCGGGATCCATGAAAACAAAAT— 结合蛋 白有 FNE、FNEB和 SFSl73种 ，其 中FNE CATTTAGA一3 ； FNE—L一2：5一GCG CTCGAGTT 和 SFS为分泌型蛋白 ]，FNEB为细胞表面锚定型 AGTCTTTTTTAGATGGTCG一3。引物的 5端分 蛋白L1。本研究 以马腺疫链球菌新疆株 FNE基 因 别添加 BamHI和 XhoI酶切位点(下划线部分)， 进行克隆测序分析及原核表达 ，为重组FNE蛋 白亚 引物 由上海生工生物工程股份有限公司合成，预计 单位疫苗 的研制奠定基础 。 扩增片段分别为 1860bp。 1 材料与方法 1．2．2 FNE基 因的 PCR扩增 按