第二章细胞工程实验室组成及无菌操作技术.pptVIP

化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。 （6）喷雾灭菌（物体表面） 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%—1%的新洁尔灭也可以。 2、化学方法 灭菌剂 使用浓度(%) 持续时间（min） 去除的难易 效果 次氯酸钙 9~10 5~30 易 很好 次氯酸钠 2 5~30 易 很好 氯化汞 0.1~1 5~8 较难 最好 抗菌素 4~50mg/L 30~60 中 较好 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 3、无菌操作技术 （1）实验器具和材料的准备 （2）用70%的酒精擦拭超净工作台，开净 化工作台和 室内紫外灯。 （3）关紫外灯、打开风机，过5~10分钟进入缓冲间。 （4）用70%的酒精擦拭台面并消毒双手及实验用具 （5）进行外植体的分离与接种 （6）完成工作后清理工作台上的废弃物，用70%的酒精擦拭台面和双手 第三节 培养基组成及其成分 一、植物细胞培养基的组成成分 二、动物细胞培养基的组成、常用培养基类 型、常用溶液 1、无机化合物 大量元素(major element) ：C、H、O、N、P、K、Ca、 Mg、S 微量元素(minor element) ：Fe、B、Zn、Cu、Mn、 Co、Mo 2、有机化合物 （1）维生素：直接参与酶的形成以及蛋白质、脂肪的代谢，常用的有维生素VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、 VB3（烟酸）、 VB9(叶酸)、肌醇以及维生素C(抗坏血酸)等 （2）氨基酸：甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等 （3）其他有机附加物：水解酪蛋白（CH）、椰子汁（CM）、麦芽浸出物（ME）、酵母浸出物（YE）等 一、植物细胞培养基的组成成分 3、碳源和能源 常用蔗糖，作为碳源和能源，同时也可维持一定的渗透压；也可用葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖等。 4、植物生长调节物质(Plant growth regulator) （1）生长素类(auxin)：促进细胞生长和分裂，用于诱导愈伤组织的形成和根的分化，常用的有2,4-D、IAA、NAA和IBA等 （2）细胞分裂素类(cytokinin)： 促进细胞分裂；诱导愈伤组织或器官的分 化，常用6-BA、KT、ZT等 （3）赤霉素类: 常用赤霉酸(GA3)，可促进幼苗茎的伸长生长和胚状体 发育成小植株 （4）脱落酸 （5）乙烯 5、固化剂 常用琼脂，一般用量为0.6～1.0％，有时可配成不加固化剂的液体培养基，进行液体浅层培养，液体培养有如下优点：低成本、生长快、移栽成活率高等。 6、其他成分：活性炭、硝酸银、抗生素等 （一）培养基的成分 1、糖类：作为碳源和能源，主要是葡萄糖，含量一般为 1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖） 2、氨基酸：12种必需氨基酸 3、维生素：包括叶酸、维生素B、烟酰胺和吡哆醇等 二、动物细胞培养基的组成、常用 培养基类型、常用溶液 4、无机盐类： 大量元素包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、PO43-等，微量元素包括Cu2+ ，Zn2+ 和Mn2+等。 5、生长类因子及激素： 血清中含有生长因子、促进细胞贴壁的因子、矿物质、激素、脂类等，另外血清可以抑制胰酶的活性。 （二）常用培养基 1、天然培养基：直接取自动物组织提取液或体液作为培养基，如血清、淋巴液、血浆凝块、水解乳蛋白、胶原等，成分复杂，来源有限 2、合成培养基：常用的有BME、MEM、DMEM、IMEM、199、F10、F12、PRMI-1640等，人工设计、化学成分明确，但缺乏各种激素和生长因子，往往需加入5%-10%小牛血清 3、无血清培养基： 组成成分已知，一般由基础培养基、激素和生长因子、基质三部分组成 （三）其他常用溶液 （1）平衡盐溶液(BSS)：主要由无机盐和葡萄糖配制而成，用于维持细胞的渗透压、维持pH值和细胞正常的代谢等；最常用的有PBS、Earl液和Hank’s液。 （2）PH调节液：NaHCO3溶液和HEPES缓冲液 （3）消化液：常用的有胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、胶原酶溶液 （4）抗生素溶液：