第章免疫细胞功能检测.pptVIP

2002-3 第五节淋巴细胞功能检测 一、T细胞功能检测 ㈠ T细胞增殖试验 1、形态学检查法 表 未转化和转化淋巴细胞的形态特征 未转化淋巴细胞 转化淋巴细胞 2、3H-TdR掺入法 3、MTT比色法 ㈡ T细胞分泌功能测定 ㈢ T细胞介导的细胞毒试验 1、形态学检查法 2、51Cr释放法 T细胞细胞毒试验示意图 ㈣ 体内试验 结核菌素试验 二、B细胞功能的检测 ㈠ B细胞增殖试验 ㈡ 溶血空斑试验 ㈢ 酶联免疫斑点试验 ELISPOT示意图 ㈣ 体内试验 三、NK细胞活性测定 ㈠ 形态学法 ㈡ 酶释放法 ㈢ 化学发光法 ㈣ 荧光标记法 ㈤ 放射性核素释放法 第六节吞噬细胞功能检测 一、吞噬细胞的分离㈠ 单核细胞的分离 ㈡ 巨噬细胞的分离 ㈢ 中性粒细胞的分离 二、中性粒细胞功能检测㈠ 趋化功能运动 1、皮肤窗法——体内试验 2、滤膜渗透法 3、琼脂糖平板法 ㈡ 吞噬功能测定1、显微镜检查法 中性粒细胞吞噬金葡菌 2、溶菌法 ㈢ 杀菌功能检测——硝基蓝四氮唑（NBT）还原试验 NBT还原试验 二、巨噬细胞功能检测㈠ 炭粒廓清试验——体内试验 ㈡ 吞噬功能检测 ㈢ 巨噬细胞溶酶体酶的测定 ㈣ 巨噬细胞促凝血活性测定 ㈤ 巨噬细胞表面受体的检测 2、间接溶血空斑试验 SRBC 取出脾细胞， 加入SRBC及补体 4天 47℃ 0.7%琼脂溶液 37℃ 加入抗鼠Ig抗体 可检测IgG和IgA类抗体形成细胞。 ◆ 只能检测抗RBC抗体的产生细胞 ◆ 只能检测动物抗体形成细胞的功能 3、被动溶血空斑试验 SRBC 待检B细胞及补体 47℃ 0.7%琼脂溶液 37℃ 1-3h 抗原 ◆ 检测SRBC上抗原相应的抗体形成细胞，应用范围较广 吸附 溶血空斑试验的应用 ⑴ 测定药物或其它因素对体液免疫功能的影响。 ⑵ 评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。 （enzyme-linked imunospot test，ELISPOT），即可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。 评价：稳定、特异、抗原用量少；可定量抗体；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。 抗原包被孔 洗涤 ＋ 洗涤 ＋ 产生抗体的B淋巴细胞 含酶底物的琼脂 酶联抗Ig抗体 适量抗原 白喉类毒素、 破伤风类毒素 待检者 检测待检者血清中相应抗体的效价 NK细胞具有细胞介导的细胞毒作用，无需致敏，即可直接杀伤靶细胞。 靶细胞：K562细胞株（人） YAC-1细胞株（小鼠） 靶细胞 效应细胞 靶细胞死亡 可被台 盼兰染色 形态学法 释放胞内酶 酶释放法 乳酸脱氢酶 碱性磷酸酶 简便易于操作 可较早反应NK活性 受主观因素影响大 无法计数轻微损伤的细胞 可定量检测 简便 靶细胞 效应细胞 效应细胞呼吸爆发 产生活性氧自由基 发光 化学发光法 鲁米诺 靶细胞 效应细胞 靶细胞死亡 荧光素 荧光素释放 TR-FIA 检测活靶细胞的荧光强度 检测速度快特异性强 靶细胞 效应细胞 靶细胞死亡 同位素 同位素释放 检测活靶细胞的放射性强度 51Cr（透过细胞膜与 胞浆蛋白质结合） 3H-TdR（参与细胞DNA合成） 敏感性高、结果客观；设备要求高、有放射污染 吞噬细胞的吞噬活动大致分趋化、吞噬和胞内杀灭作用三阶段，可分别对这三个阶段进行功能检测。 吞噬细胞 单核吞噬细胞 中性粒细胞（血液中） 单核细胞（血液中） 巨噬细胞（组织中） 特征性标志 CD14 Pecoll密度梯度分离法 流式细胞仪分离技术 免疫磁珠分离法：目前较常用的方法 黏附法 用斑蝥敷贴法可从人体组织渗出液中获取巨噬细胞。该法是用10％中药斑蝥酒精浸出液刺激前臂内侧皮肤表面，48h后局部形成水疱，吸取疱中的组织液，内含巨噬细胞。 欲获取小鼠、豚鼠等小动物的巨噬细胞，可经腹腔内注入少许石蜡油，3～4天后冲洗出腹腔渗出液，所得细胞悬液中70~80％为巨噬细胞。 聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞 Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞 (抗凝血) 血浆 RBC WBC 中性粒细胞的运动可以分成随机运动和定向运动，前者类似于布朗运动；定向运动表现为趋化运动。 在受检者前臂屈侧中央3mm范围内，搔刮皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12，24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始时间、聚集程度等。健康正常人一般2～3h后开始聚集，达50～100个，6小时可达1000个以上。 又称Boyden小室法。上室加待检细胞，下室加趋化因