利用疏绵状嗜热丝孢菌几丁质酶基因提高水稻抗病性研究.pdf

…～ 中文摘要………………………………………………………………………：：：__。一…I 8 2．2．6琼脂糖凝胶纯化特异DNA片断………………………………………………………l 2．2．7与载体连接……………………………………………………………………………．19 2．2．8大肠杆菌感受态细胞的制备和转化…………………………………………………．19 2．2．8．1大肠杆菌DH5a感受态的制备……………………………………．．．．……………．．19 2．2．9菌落PCR检测…………………………………………………………………………20 2．2．10序列测定………………………………………………………………………………一20 2．3Lan425基因在水稻中的转化及抗性分析………………………………………………2l 2．3．1水稻表达载体的构建…………………………………………………………………．21 2．3．2提取质粒………………………………………………………………………………．21 2．3．3质粒DNA的双酶切鉴定………………………………………………………………22 2．3．4．1农杆菌感受态细胞的制备…………………………………………………………一22 2．3．4．2 DNA直接转化农杆菌………………………………………………………………23 2．3．4．3重组农杆菌鉴定……………………………………………………………………一24 2．3．5农杆菌介导的水稻愈伤的遗传转化过程……………………………………………．25 2．3．5．1愈伤诱导……………………………………………………………………………一25 2．3．5．2愈伤继代……………………………………………………………………………一25 2．3．5．3预培养………………………………………………………………………………一25 2．3．5．4农杆菌准备…………………………………………………………………………一25 2．3．5．5农杆菌悬浮培养准备………………………………………………………………．．25 2．3．5．6农杆菌侵染(共培养………………………………………………………………一25 2．3．5．7水洗和筛选…………………………………………………………………………一25 2．3．5．8预分化与分化………………………………………………………………………一26 2．3．5．9生根………………………………………………………………………………………………………………26 2．3．5．10移栽……………………………………………………………………………………………………………．26 2．3．6转基因水稻植株的分子生物学检测…………………………………………………．26 2．3．6．1水稻基因组的提取…………………………………………………………………一26 II 2．3．6．2转基因植株的PCR检测……………………………………………………………．27 2．3．6．3 RT—PCR检测…………………………………………………………………………………………………27 2．3．6．4转Lan425基因水稻与非转基因水稻几丁质酶基因活性的测定…………………28 2．3．6．5转基因水稻的抗病性检测…………………………………………………………一28 3结果与分析…………………………………………………………………………………29 3．1疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces 3．1．1疏绵状嗜热丝孢菌总RNA的提取……………………………………………………29 3．1．2疏绵状嗜热丝孢菌Lan425基因的克隆………………………………………………29 3．1．3疏绵状嗜热丝孢菌几丁质酶基因的核苷酸和氨基酸序列分析……………………．30 3．1．4蛋白质的保守结构域分析……………………………………………………………．32 3．1．5信号肽分析……………………………………………………………………………．32 3．2疏绵状嗜热丝孢菌几丁质酶基因Lau425在水稻中的转化及抗病性分析…………一33 3．2．1几丁质酶基因酶切位点的分析………………………………………………………．33 3．3．3转化农杆菌……………………………………………………………………………．36 3．3．4 pCAMBIAl 3．3．4