大曲华根霉(Rhizopus+chinensis)固态发酵表达酯合成脂肪酶的研究.pdf

摘要 摘 要 chinensisCCTCCM201021)是从白酒大曲中分离得到的一株丝 华根霉(Rhizopus 状真菌，其在固态发酵过程中能够合成多种酯合成脂肪酶。为研究华根霉同体发酵产酯 合成脂肪酶的特点和形成机理，本论文开展了系统的研究。通过优化华根霉固态发酵的 培养条件和参数，大量制备菌体结合酯合成脂肪酶，然后对这些脂肪酶蛋白进行分离纯 化和酶学性质研究，并在蛋白质分子水平上与液体培养条件下的脂肪酶进行对比，发现 和确认了固态发酵所特有的酯合成脂肪酶，并详细分析固态发酵特殊的环境条件对特征 性脂肪酶产生的影响，揭示了诱导特征性酯合成脂肪酶表达的关键凶素。具体结果如下： (1)华根雹固体发酵产全细胞酯合成脂肪酶的培养基和培养条件优化 为进一步提高华根霉菌体结合脂肪酶的生产水平，获得一定数罩的目的酶用于后续 研究，对发酵培养基各主要成分含量和发酵条件进行了单因素考察和优化。以脂肪酶合 成活性为指标，得到的培养基组成为(w／w)：小麦18％，麸皮12％，乳糖2％(补充碳 源)，蛋白胨2％(补充氮源)，橄榄油2％(v／w，诱导物)，K2HP040．3％，MgS047H20 0．07％；最佳产酶条件为：起始水分含量70％，接种量106孢子儋干幕，培养温度30℃， h。优化后的培养基将菌体结合酯合成脂肪酶的活力提高伞 初始pH值6．5，培养时问72 24432 U／kg干基，为优化前培养基酶活的4．1倍。 (2)华根霉固态发酵酯合成脂肪酶的分离纯化 为在蛋白质水平上研究固态发酵表达的酯合成脂肪酶，需要对其进行分离纯化。将 X．1 R．chinensis固体发酵的细胞破碎后，利用Tritonoo提取胞膜粗蛋白，然后经过硫酸 75凝胶过滤层析得到两个酯合成脂肪酶同工酶，分 铵沉淀、丁基疏水层析和Superdex kDa，SS 别命名为SSLl和SSL2。SSLl的分子量约为64L2的分子量是33kDa。利川 相同的步骤纯化R．chinens括液态发酵的酯合成脂肪酶，也得到了两个脂肪酶同工酶，分 液体发酵的共有蛋白质，而SSLl则可能是与固体发酵相偶联的特征性脂肪酶，而且 SSLI与已报道的根霉脂肪酶的同源性很低，应该是一种新型的脂肪酶。 (3)固态发酵特征性酯合成脂肪酶(SSLl)的生化性质研究 以水解活性为表征，对纯化的固态发酵特征性酯合成脂肪酶(SSLl)的酶学性质进 行研究，结果表明，SSLl水解活性的最适反应温度是40℃，其在50℃以下保留1h仍 6．5～8．0的条件下也比较稳 然能维持原始活性的80％以上；最适反应pH为8．O，在pH 对三氯叶{烷、正己烷等有机溶剂有较好的耐受性。底物特异性研究表明，该脂肪酶对巾 长链的脂肪酸酯具有较高的水解活性，对硝基苯酚棕榈酸酯(C16)是其最适底物。以 合成活性为表征，纯化的SSLl最适pH记忆是7．5，最适反应温度是30℃。在有机相中 催化合成脂肪酸乙酯的研究表明，以乙醇为酰基受体时，SSLl的最佳酰基供体足肉豆 蔻酸，而且对于碳链长度大于8的中长链脂肪酸，该脂肪酶也表现出较高的酯合成的能 摘要 』_jo 性及有机溶剂耐受性等方面显著优于SMLl。另外，两者在金属离子的影响、水解底物 特异性、pH记忆以及合成反应的最佳酰基供体等酶学特性和催化特性上也存在一定差 异。 (4)抗SSLl兔多克隆抗体的制备以及SSLl特征性的验证 为了验证SSLl是固体发酵过程中产生的特征性酯合成脂肪酶，利用纯化的SSLl 为抗原免疫新西兰大白兔制备抗SSLl多克隆抗体，经4次免疫后，血清效价达l：10000。 多克隆抗体经ProteinA亲和柱层析后，纯度完全符合检测要求。利用免疫印迹分析固 态发酵和液念发酵的蛋白表达情况，结果表明，多克隆抗体能够与固体发酵的胞内和胞 膜籼蛋门发生特异性反应，证明SSLl存在于固体发酵的细胞内和细胞膜上；但是抗