糖多孢红霉菌糖基转移酶突变体的构建及其产物鉴定.pdfVIP

摘 要 糖多孢红霉菌糖基转移酶突变体的构建及 其产物鉴定 摘 要 红霉素（erythromycin ）是一类应用于临床上的大环内酯类抗生素，由糖多 孢红霉菌（Saccharopolyspora erythraea ）发酵产生。它在保障人类健康方面发挥 了重要作用，但令人困惑的是日益严重的耐药性问题。目前已经上市了化学半合 成第三代红霉素，但是化学方法有步骤繁琐、引起环境污染等缺陷。探索基因工 程方法改造红霉素合成过程，可为新型抗生素的研发开辟新的途径。 糖基是许多抗生素母环合成后添加的基团，是其发挥抑菌生物活性所必不可 少的组分，也是影响生产菌自我保护等功能的结构基础。通过对糖基的改造可以 合成新的代谢产物，而改变糖基转移酶又是改造糖基的主要途径之一。在红霉素 合成过程中有两个糖基化过程，一个是大环 C-3 位上的糖基化，一个是 C-5 位上 的糖基化。糖基转移酶EryB Ⅴ和 EryCⅢ分别负责这两个糖基化反应。本文以这 两个糖基转移酶为对象，利用同源重组的方法构建两个糖多孢红霉菌突变体，探 索改造糖基结构、合成红霉素衍生物的基因工程新途径。 为了失活糖基转移酶 EryB Ⅴ和EryCⅢ，本研究采取基因敲除的方法分别缺 失它们的编码基因 eryB Ⅴ、eryCⅢ。为了实现这一效果，分别设计删除这两个基 因中 130bp 碱基得到失活的 ΔeryB Ⅴ、ΔeryCⅢ片段，各在删除部分前后选择 1000bp 左右的片段进行扩增，形成突变基因的两个同源臂，克隆至 pUC18 质粒 上构建 pUC18-ΔeryB Ⅴ和 pUC18-ΔeryCⅢ。鉴定后再将ΔeryB Ⅴ和 ΔeryCⅢ亚克 隆至同源重组型质粒 pWHM3 上，分别构建同源重组质粒 pWHM3-ΔeryB Ⅴ和 pWHM3-ΔeryCⅢ。接着将它们分别导入糖多孢红霉菌 A226 原生质体中，经硫 链丝菌肽抗性筛选出 A226/pWHM3-ΔeryB Ⅴ和 A226/pWHM3-ΔeryCⅢ整合体菌 株各一株，对两者进行生物活性试验和薄层层析，显示质粒的整合均破坏了红霉 I 糖多孢红霉菌糖基转移酶突变体的构建及其产物鉴定 素合成途径，红霉素 A 无法正常合成，由此鉴定出两者分别整合到糖多孢红霉 菌红霉素合成基因位点。然后，根据 pWHM3 质粒在无抗环境下的不稳定性，通 过抗性负筛的方法进行突变体菌株的筛选，挑取大量克隆检测后筛出 1 株缺失 EryB Ⅴ酶活性和 1 株缺失 EryCⅢ酶活性的糖多孢红霉菌，分别命名为 A226-ΔeryB Ⅴ和 A226-ΔeryCⅢ。两个突变体的生物活性试验表明在分别缺失糖 基转移酶 EryB Ⅴ和EryCⅢ活性的情况下，它们的发酵产物对枯草芽孢杆菌都没 有抑制作用；进一步的薄层层析结果显示 A226-ΔeryB Ⅴ和 A226-ΔeryCⅢ都不积 累红霉素 A ；最后通过质谱分析发酵产物，对它们分子量大小的测定以及对比发 现 A226-ΔeryB Ⅴ积累红霉内酯 B （EB ），A226-ΔeryCⅢ积累 3-L-mycarose-红霉 内酯B （MEB ）。随后，将eryB Ⅴ和 eryCⅢ基因分别克隆至表达质粒 pZMW 上， 导入对应的突变体，结果恢复了突变菌株合成红霉素的能力。 本论文成功构建了两个糖基转移酶突变体 A226-ΔeryB Ⅴ和 A226-ΔeryCⅢ， 这为后续改造糖基结构，合成新的前体或新的红霉素衍生物铺平了道路。此外， 两个糖基转移酶编码基因的正确克隆也为进一步研究其酶学特性，将它们应用到 组合生物学中合成新物质打下了基础。 关键词： 糖多孢红霉菌；糖基转移酶；同源重组 II ABSTRACT Construction of glycosytransferase mutants in Saccharopolyspora erythraea and