NRAGE基因除对成骨细胞功能影响的研究.pdfVIP

摘要 摘要 骨骼是一个动态、处于新陈代谢的组织。人的一生可通过骨形成和骨吸收构成的骨 重建过程维持骨的更新。其中，骨形成由成骨细胞调控，骨吸收则由破骨细胞调控。两 种细胞功能的异常或耦联的异常将导致以骨质疏松为代表的多种骨代谢疾病的产生。 MAGE NRAGE(neurotrophinreceptor-interactinghomolog)，即黑色素瘤抗原编码 要集中在细胞凋亡、细胞周期和细胞分化等方面。目前尚未有关于NRAGE与骨骼发育 关系的报道，但是，已有文献表明，该基因在附肢骨和头盖骨内丰富表达；而NRAGE 的原位杂交结果也显示，在指／趾形成过程中，该基因在软骨雏形周围细胞层中强表达11l。 以及转录因子dlx5和msx2i¨。这些受体或转录因子可在骨发育或骨代谢过程中发挥重 要作用。这些信息提示我们：NRAGE可能在维持骨代谢稳态中发挥重要作用。而随后 确是一个新的骨代谢调控分子。该基因的敲除导致小鼠骨质疏松的发生，表现为骨密度 降低，骨超微结构发生退行性变化。而且，我们也从整体和细胞水平证明，该敲除小鼠 骨质疏松表型与破骨细胞过度分化和激活有关。众所周知，骨代谢稳态是成骨细胞和破 骨细胞共同作用的结果，那么，NRAGE基因敲除导致的骨代谢紊乱是否与成骨细胞的 功能变化有关系?鉴于此，我们分离并原代培养了NRAGE基因敲除小鼠的成骨细胞， 通过增殖、分化和共培养等实验详细分析了NRAGE基因敲除后成骨细胞功能的变化， 论文主要内容如下：1．明确NRAGE基因敲除对小鼠血清中钙、磷和相关激素水平的影 敲除对成骨细胞与破骨细胞耦联的影响及可能的机制探讨。 主要实验内容如下： 第一部分：NRAGE基因敲除并不影响体内钙磷沉积和激素PTH、CT的变化 本实验分离收集不同年龄段的敲除和野生小鼠血清(分别为3～4个月，9个月和15 个月)，用比色法检测了其中钙、磷的含量，结果表明，与野生小鼠相比，不同年龄段 摘要 的敲除小鼠血清钙、磷含量均没有明显变化，提示NRAGE基因敲除不会影响体内钙磷 的沉积。 用放免法检测不同年龄段(3~4个月，9个月和15个月)敲除小鼠和野生小鼠血清 降钙素和甲状旁腺激素的水平发现，尽管NRAGE基因敲除可提高PTH和CT的水平， 但与野生小鼠相比，并没有统计学差异，提示：NRAGE基因敲除并不影响PTH和CT 的分泌。 第二部分：N-RAGE基因敲除对骨形成的影响 为了比较成骨细胞的骨沉积速率，我们分2次向NRAGE敲除型和野生型小鼠的腹 腔注射了钙黄绿素，并对其进行硬组织切片，双标线结果表明，NRAGE基因敲除，可 促进骨沉积，骨形成速率提高。 为检测NRAGE基因敲除导致的骨量减少是否由于骨髓问充质干细胞中成骨前体 细胞数量减少导致，我们分离并低密度培养NRAGE基因敲除和野生小鼠的骨髓间充质 干细胞至3周， ALP染色表明，与野生小鼠相比，NRAGE基因敲除小鼠骨髓间充质 干细胞中骨原细胞的数量没有变化。 为检测NRAGE基因敲除对成骨细胞增殖能力的影响，本实验利用计数法和流式细 胞术分析了成骨细胞的增殖情况，结果表明，敲除小鼠成骨细胞增殖能力增强。 为检测NRAGE基因敲除对成骨细胞分化能力的影响，本实验分离并对成骨细胞进 行了诱导培养，ALP染色、von Kossa染色和qacg的结果共同表明，该基因敲除可明 显促进成骨细胞的分化能力以及矿化能力。 表达降低导致C2C12细胞成骨分化增强。 第三部分：NRAGE士成骨细胞可促进破骨细胞的分化过程 为检测NRAGE基因敲除对成骨细胞．破骨细胞耦联的影响，本实验采用共培养的 测表明，NRAGE--成骨细胞可明显促进破骨细胞的分化过程，该促进作用可能是通过提 高RANKL／OPG的比值来实现的。 主要结论： 1．NRAGE基因敲除不影响体内钙磷沉积和激素PTH、CT的水平； IV 摘要 2．NRAGE基因敲除可明显促进骨形成过程，主要表现为骨形成速率增加，成骨细胞 增殖能力和分化能力增强； 3．NRAGE4成骨