NSE单抗的制及双抗夹心ELISA检测方法的建立.pdfVIP

摘要 摘要 enolase，NSE)是烯醇化酶的一种同工 神经元特异性烯醇化酶州euron．specific 酶。目前已发现5种烯醇化酶的同工酶aa、pp、、伍p、0ry、W、吖组成的同工 酶为神经元和神经内分泌细胞所特有，故命名为神经元特异性烯醇化酶。当缺血、 缺氧、中毒或损伤时，细胞膜的完整性受到破坏，NSE便从细胞内释放出来。从 而进入血液循环。目前NSE已成为小细胞肺癌及神经母细胞瘤诊断中最敏感的肿 瘤标志物，它对神经系统及神经内分泌系统肿瘤的诊断、治疗及预防都有很高的 临床价值。 我们通过基因工程技术克隆人的神经元特异性烯醇化酶，通过工程菌株的表 达来获得足够量的NSE融合蛋白，对其纯化后，免疫Balb／C小鼠。采用常规杂 交瘤技术进行细胞融合，通过间接ELISA法进行筛选，获得多株可稳定分泌NSE 单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。将获得的阳性杂交瘤进行腹水制备并纯化，并 对抗体的亚型进行鉴定，采用ELIsA、wB、IP、IF、IHc等技术对这些单克隆抗 体进行分析。免疫印迹结果显示，该抗体不仅能识别细胞内源的NSE蛋白还能识 别分泌到细胞培养上清液中的NSE蛋白，此外该抗体还可用于免疫荧光及免疫组 化检测。通过对这些NsE单克隆抗体进行的一系列鉴定和效价检测，我们从中挑 出一株NSE单克隆抗体，用辣根过氧化物酶(HRP)对其进行标记。采用棋盘滴定 实验建立了双抗夹心ELISA检测系统，并对双抗夹心ELISA检测系统的封闭条 件及酶标抗体作用时间进行了优化，最后确定分别以群3NSE单克隆抗体为包被抗 体，槲NSE单克隆抗体为酶标检测抗体，初步建立了可检测NSE蛋白的双抗体夹 测系统具有良好的灵敏度。该试剂盒4℃可放置3个月，具有良好的稳定性，为 基础研究和临床应用打下了基础。 关键词：神经元特异性烯醇化酶；单克隆抗体；双抗体夹心ELISA Abstract Abstract isconsistedof and Neuron—specificenolase(NSE)f．am．1yaa，pp，1吖，apa丫subunits． arefoundinneuronsandneuroendocrinewere Theand吖isoenzymes ceIls，they enolases．NSEwouldbercleasedfIromcells accordinglydesignatedneuron—specmc at whenneuronal occurredmecenmembraneaRer damage ischemia，hypoxia， or becamethemostsensitiVetumormarkerin ofsmalI injuD，．It diagnosis poisoning cell cancerandneuroblastoma．Itan clinicalrolein lung pIaysincreasinglysignificant andtreatmentofnen，ous andneuroendocrinetumorS． diagnosis system WeclonedNSEandconstr．ucted ofNSE．ARersuccessml gene expressionplasmid 0f NSE wasusedt