PAK6通过泛化负向调节前列腺癌细胞雄激素受体信号通路.pdfVIP

．中文论著摘要· PAK6通过泛素化负向调节前列腺癌细胞 雄激素受体信号通路 目 的 前列腺癌是欧美国家最常见的恶性肿瘤之一，在导致男性死亡的癌症中排第 性死于此病。因此，它依旧是威胁人类健康的一个主要问题。早在六十多年前， 就已经证实雄激素在前列腺癌的发生发展中起重要作用。因此，去除雄激素也称 去势治疗成为前列腺癌治疗的主流。这种治疗方式最初是有效的，然而，在去势 治疗2．3年后，复发性前列腺癌中的雄激素信号转导通路又恢复了，雄激素受体 在雄激素剥夺后也担当着重要的角色。前列腺癌的发病原因迄今仍不清楚，目前 认为激素、人种、遗传和饮食习惯等与发病都有比较密切的关系，其中雄激素在 前列腺(癌)的生长、转移与分化中起决定性作用，由雄激素依赖性转变为雄激素 非依赖性是每个致死性前列腺癌细胞的根本特性。目前没有治疗复发性前列腺癌 的有效方案，因此，研究雄激素受体信号通路为分析前列腺癌的发生发展提供更 多的依据，并为新的诊断治疗策略提供理论基础。 雄激素与雄激素受体结合后发挥转录因子的作用，调控大量下游靶基因的表 达，同时又受到雄激素受体关联蛋白等旁路信号的调节。雄激素受体是核受体超 家族的配体依赖式转录因子，其信号通路对包括前列腺在内的男性泌尿生殖系统 的发育、功能及稳定是必不可少的，并且在前列腺癌的发生发展以及侵袭转移中 起到重要作用。在前列腺癌的各个阶段中，雄激素受体都有一定程度的表达，并 且在人及动物模型研究中发现，前列腺癌的原发灶及转移灶中雄激素受体的表达 水平与疾病的进程相关。然而雄激素受体并不是独立的对雄激素产生应答，而是 需要与不同的转录辅因子发生相互作用而发挥其应答作用。无论是雄激素受体白 身的改变还是其转录辅因子的改变都能导致AR信号通路的异常。因此，雄激素受 体本身及其相关的辅助调节因子影响着前列腺癌的发生发展。尽管对AR的转录辅 因子的调节功能做了大量的研究，但它们在前列腺癌中的作用仍有待于进一步探 索。 p21活化激酶(p21．activatedkinase，PAK)，为一类进化上保守的丝氨酸／ 苏氨酸蛋白激酶。PAl(在许多组织中广泛表达，作为小G蛋白Rho家族Cdc42 和Racl的下游靶蛋白，可以被生长因子及其他胞外信号通过GTP酶依赖的信号 通路或非GTP酶依赖的信号通路活化，发挥多种生物学效应。PAK作为一种重 要的生物学调节因子，在哺乳动物细胞中具有重要作用，如：细胞运动、细胞生 存、细胞周期、血管生成、基因转录调节及癌细胞的侵袭转移。通过对PAK家 族成员信号转导机制的研究，有望为癌症治疗提供分子靶标。 到目前为止PAK家族共有6个成员：PAKl一PAK6，根据他们的结构特点及相似 它们的催化区中有80％．90％的序列同源性。较晚发现的第二亚类中含：有PAK4、 化区序列同源性只有40％．50％，两类PAK在结构组成和调节上都有很显著的差异， 也预示着它们有着不同的下游效应器。目前对II类PAK的研究主要是与肿瘤相关的 细胞凋亡、细胞骨架调节、细胞黏附以及非锚定依赖性生长。PAK6作为II类PAK 的一员，有报道PAK6能与雄激素受体相互作用作为转录抑制子下调其转录激活活 性。 本研究在体内外证实PAK6能够与雄激素受体AR发生相互作用，首次发现 PAK6可定位于内质网；筛选出PAK6在雄激素受体AR卜的磷酸化区域及位点。 用共聚焦激光显微镜技术，免疫共沉淀和启动子报告基因等细胞生物学技术研究 PAK6在调控AR信号转导通路中的功能及其机制，探讨PAK6在前列腺癌发生发展 中的作用，为寻找前列腺癌的治疗靶点提供理论依据。 方 法 一、PAK6与AR在体内外的相互作用及磷酸化位点的筛 选 down实验鉴定PAK6与AR在体外的相互作用并确定其作用 1、用GST-pull 区域。 克隆PAK6和AR基因及其截短突变片段，构建至不同质粒载体中：GST-pull down实验确定PAK6与AR相互作用区域。 2、利用激酶分析实验筛选PAK6对AR的磷酸化位点。 3、在工具细胞HEK293中，共焦激光扫描显微镜观察PAK6的亚细胞定位。 4、免疫共沉淀实验确定PAK6，AR与内质网标志蛋白在细胞内的相互作用。 5、在工具细胞HEK293中，共聚焦激光扫描显微镜观察