orf60a和ecA对Red重组效率的影响及新型载体pKR和pRedIG的构建.pdfVIP

摘要 摘要 MediatedGen缸c 重组工程技术(Recombination Engine甜ng)是随着功能基 因组研究的需要，建立起的一项高效的基于体内同源重组的遗传工程技术，是由 重组酶催化发生在短同源序列问的同源重组进而可以在大肠杆菌中进行基因克 隆或改造的一种技术。 噬菌体Red系统完全不同于传统的依赖RecA蛋白的大肠杆菌重组系统，特 点是使用短至36bp的同源臂高效率地催化体内同源重组反应。体内重组过程不 需要限制性内切核酸酶和连接酶，无酶切位点和片段大小的限制，只需要在体外 合成简单的寡核苷酸同源序列，或者用PCR方法扩增线性打靶序列，便可在大 肠杆菌体内对染色体DNA、BAc和PAc质粒或普通质粒载体进行精确的修饰。 大多数情况下，这些构建都可以在一周以内完成。 5’ 重组工程中的重组酶主要是来源自九噬菌体三个基因，其中地d嘲码DNA 端至3’端的外切酶，其使双链DNA打靶分子解链而产生3’端突出单链分子；陀筇 编码单链结合蛋白，其与DNA分子的3’悬突单链结合，还具有重组酶活性，促进 两个单链、同源DNA分子之间的退火产生重组DNA；阳办基因的作用则是抑制 大肠杆菌RecBCD对外源DNA的降解。 源于重组酶系统pKD46的。哟D口及大肠杆菌中的re叫基因对重组效率的提 高都具有一定的促进作用。 为了进一步研究D耥和陀叫两个基因在重组效率上的协同(或拮抗)作 S廿and 用，本论文采用了两种验证作用方式：DSBR(Double Breal【Repair，双链 s缸锄d 断裂修复)和sSoR(Sill91eOligoRepair单链寡核苷酸修复)，前者是通 过PCR手段获得含与靶分子两端相同同源臂的双链DNA进行Red重组置换， 后者则是直接合成单链寡核苷酸，其特点是引入突变碱基，两端也需要设计含有 与靶分子两端相同同源臂，寡核苷酸直接进行Red重组置换。 最后得出了以下结论：1、含突变的Red(朋陀d)重组表达系统的重组载体 重组效率远远低于未经突变的Red(心d)重组表达系统的重组载体重组效率；2、 D，．佑D口和re“在大部分实验条件下具有很强的协同作用，但是在某些情况下也 存在一定的拮抗作用，具体原因不明，这有待进一步的研究；3、利用Red重组 在构建克隆上的各种优点，我们分别构建了可与克隆载体pKS替代使用的pKR 一定程度上证明了Red重组工程法在克隆构建上的优点。 关键词：重组效率，D枷∞，旭鲥，DSBR，SSOR‘ Ⅱ AbSt瞅 AbStraCt Gen觚c ane伍cient Recombineering(RecombinationM9diatedEngiIleerin曲is me吐10dof加VfVD to风锄e，-f锄缸∞，f or geneticen舀nee血gapplicable g渤me DNA． episomaLl his amodificationandDNA matmakes technique 11Seof clor血g recomb曲mionb