微藻电击转化方的建立及新型载体的构建.pdfVIP

微藻电击转化方法的建立及新型载体的构建 专 业：生物化学与分子生物学 硕士生：郑永卿 指导教师：李国富副教授 摘 要 杜氏盐藻(Dunaliella reinhardtii)均为单 salina)和莱茵衣藻(Chlamydomonas 细胞真核绿藻，因其有着生长周期短、光合自养、培养基低廉以及容易进行实验 操作等优点，具有重要的生物工程应用价值，是理想的生物反应器。本文成功建 立了针对杜氏盐藻和莱茵衣藻的电击转化方法，构建了含酵母自主复制序列和着 丝粒序列的新型载体并进行了转化，分析了其稳定性。 种常用抗生素的敏感性，分别确定了其遗传转化的筛选标记以及筛选转化子的最 佳抗生素浓度。对于杜氏盐藻，氯霉素是比较合适的筛选抗生素，其对应的筛选 标记基因是CAT基因，液体培养时的筛选浓度为400pg／ml，固体平板培养时的 筛选浓度为200pg／ml；对于莱茵衣藻，最佳的筛选抗生素为博莱霉素，其对应 的抗性基因为6彪基因，液体培养时的筛选浓度为0．2pg／ml，固体平板培养时的 筛选浓度为2pg／ml。 kV／cm 件、藻的生长状态对转化率的影响，结果得出培养10天的盐藻细胞在7 的脉冲电场强度、50心电容、400Q电阻条件下可获得较高的转化率。利用电击 电场强度下都可以获得较高的转化率。 化率和稳定性进行了研究。结果发现，酵母ARS和CEN序列的掺入并没有提高 转化效率，也不能提高外源基因在微藻细胞中的稳定性。 以上工作明确了杜氏盐藻和莱茵衣藻的筛选标记，成功建立了其电击转化体 系。在此基础上，构建了新型载体并进行了转化莱茵衣藻和杜氏盐藻的初步研究， 为真核微藻表达系统的载体构建拓宽了思路。 关键词：莱茵衣藻，杜氏盐藻，电击转化，载体，ble基因，CAT基因 II of andconstructionof electroporation Optimization newvectorsfor transformation microalgae andMolecular Major：Biochemistry Biology Name： ZhengYongqing Supervisor：LiGuofu(Assoc．尸阿) ABSTRACT Dunaliellasalinaand reinhardtiiareunicellular Chlamydomonas eukaryotic oftheirshortlife culture greenalga,because cycle，photosyntheticcapacity，cheap mediumand of areidealbioreactors．Herewe simplicitytransformation,they present theestablishmentof forthetwo andconstruction electroporationmicroalgaes