微量复杂生物样糖蛋白N-糖链电喷雾电离质谱分析前处理方法的建立.pdfVIP

微量复杂生物样品糖蛋白Ⅳ-糖链电喷雾电离质谱分析 前处理方法的建立 摘要 糖生物学是21世纪生命科学研究的重要组成部分。要深入研究糖链在生命活动中 的功能和调控机制，首要任务是获得并分析生物糖组。电喷雾电离质谱(ESI．MS)是目 前分析微量糖组的强大工具，但对样品的前处理要求高。本文针对目前存在的问题建立 了微量复杂生物样品糖蛋白Ⅳ-糖链电喷雾电离质谱分析前处理的方法。 本研究先以牛胰核糖核酸酶B和鸡卵清白蛋白二种常见的糖蛋白为研究材料，对几 种Ⅳ-糖链解离、富集纯化方法进行了考察，得到以下结论： 然后加入Ⅳ-糖苷酶F(PNGaseF)，37℃反应24h。这种方法解离效果好，效率最高， 操作简单。 2．Ⅳ-糖链富集纯化方法：我们将富集纯化方法联合使用，对解离样品进行质谱分析 前处理，结果表明，除了微晶纤维素和阳离子交换树脂混合装柱法外，其余4种方法(微 晶纤维素柱结合阳离子交换树脂，C18柱结合活性炭柱，C18柱结合阳离子交换树脂和 活性炭柱结合微晶纤维素柱)均可以达到满意的富集纯化效果。 我们将初步建立的方法用胎牛血清，健康小鼠血清，健康人血清，小鼠HAbl8 IgG 以及HAbl8 IgG(腹水法)这5种生物样品进一步验证，并针对微量样品进行了改进： 3．PVDF膜辅助Ⅳ-糖链解离方法：我们利用PVDF膜能够结合蛋白质的特性，在释 放糖链前对复杂生物样品进行粗纯化，再按照上述糖链解离步骤，直接在膜上完成糖蛋 白变性和糖链解离过程。实验证明，这种方法能同时提高微量样品糖链纯化效果。 4．改进的Ⅳ．糖链富集纯化方法：上述4种富集纯化方法中，只有活性炭柱联合微晶 纤维素柱纯化生物来源Ⅳ-糖链解离样品的效果最好。在用活性炭柱进行纯化时，为了 避免糖链洗脱不完全，我们用含0．1％氟乙酸的50％的乙腈溶液为洗脱剂；微晶纤维 素柱的平衡时间与填料多少成正比，平衡效果好坏直接影响纯化效果，而微量样品只需 要少量的微晶纤维素，因此我们采用1000肛L移液器标配枪头作一次性层析柱，可以大 大减少干扰物，提高纯化效率。 综上所述，本研究在电喷雾质谱检测技术的基础上，建立了一个更适合于微量生物 来源样品糖蛋白Ⅳ-糖链解离，富集纯化的新方法——采用PVDF膜辅助Ⅳ-糖链解离方 法以及活性炭柱联合微晶纤维素柱的富集纯化方法。这种方法快速，稳定，通用性更强， 能够通量化应用于ESI—MS检测前腭级别生物样品糖蛋白Ⅳ-糖链的制备，有利于糖组 的后续研究。 关键词 微量分析，肚糖链，电喷雾电离质谱 APretreatmentProcedureforN-linked Releasedfrom Glycans inMicro-scale Basedon Glycoproteins Bio—samples IonizationMass Analysis Spectrometry Abstract in21 have isan oflifescienceresearchstcentury．To Glycobiologyimportantpart of ofthefunctionsand mechanism inlife in-depthstudy regulatory glycans activities，the tasktoobtainand