恶臭假单胞菌K2440的重组工程法基因敲除.pdfVIP

摘要 摘要 mediated 重组工程(Red／ET,recombinationgeneticengineering)是一种基于噬 菌体同源重组系统的重组技术。Red／ET重组就是九噬菌体的Red蛋白组合 工程方法理论上可以对细菌基因组任意大小的DNA片段进行敲除和修饰，重组 工程的优点由于是利用PCR所获得的DNA片段进行转化，省略了基因克隆步骤， 因而简便、快速而高效。研究证实，重组工程方法可以用于多种细菌和真菌，这 个方法首先在大肠杆菌中构建出来，随后推广应用到曲霉、耶尔森菌、沙门氏菌 和志贺氏菌等微生物中。 恶臭假单胞菌KT2440是在生物降解环境有机物和表达异源基因等方面很具 重要作用的环境微生物。基因敲除是研究基因和蛋白的功能和构建具不同生物学 活性菌株的必需手段。常规的基因敲除手段往往需要繁琐耗时且易引入突变的基 因克隆操作。 本文报道了一种利用重组工程对Pseudomonas putida 菌株进行基因敲除的可行性，实验的做法是，通过OE．PCR扩增获得带有同源臂 细胞，将以上获得的DNA片段电转入上述的感受态细胞，利用卡那霉素抗性平 板筛选。实验表明，重组工程方法能在恶臭假单胞菌菌株中发挥高效作用；为了 实现无冗余的基因敲除，本课题已经尝试了四环素抗性基因tet作为可消除正负 筛选抗性标记的可行性以及基于Cre位点特异性重组酶的抗性消除体系，实验表 明，四环素抗性基因不能用作KT2440的可消除抗性标记，而基于Cre位点特异 性重组酶抗性消除体系能够高效发挥作用而消除抗性片段，具体的做法是由PCR 获得含同源臂和loxP位点的r／eo基因盒整合至基因组正确位点。获得的带有卡 那霉素抗性基因的敲除菌株通过诱导Cre重组酶的表达促使细胞发生分子内重 组，从而实现只残留一个loxP位点的基因敲除。本课题还将尝试基于归巢内切 酶I-SceI双链断裂修复实现完全无冗余的基因敲除。 功能基因组学研究提供一种有效方法。 关键词：恶臭假单胞菌KT2440，重组工程，基因敲除 Ⅱ Abstract Abstract a recombinant basedonthe techniques Recombineering(RexⅣeT)is of and recombinationwhichconsists homologous system RedQ，ReAl3 bacteriophage RecT fromRac from RecEand Re嘶proteinsphage九or proteins prophage． has inknockoutandDNA Recombineeringmanyadvantages aS aIm DNA PCRcall fragmentgeneratedthrough homologousmA)flakedtargeting be transformedintothe cellswithom directly electrocompeten