高灵敏电化学发及荧光相关光谱检测新方法及其在生物分子检测中的应用.pdf

At of CollegeBiophotonics， Normal SouthChina University June，2010 2 摘要 生物分子的识别和定量技术是生命科学、医学、食品分析化学等领域能够得到 迅速发展的基础。传统的分析工具和方法由于在灵敏度、特异性、操作简便性、 快捷性等方面存在缺陷，因此难以满足日益发展的生物分子高灵敏检测的需求。 电化学发光是一种灵敏度高，特异性好，仪器装置简单的新型化学发光分析技术， 结合分子标记以及生物学特异性ie,另q原理，电化学发光技术已经广泛应用于生物 学检测领域。荧光相关光谱是一种能从单分子层面解析分子间相互作用、分子动 力学特性、以及分子定量化信息的光学技术。本论文主要以这两种技术为基础， 结合新型研究工具和材料，以解决生物学热点、难点问题为出发点，发展新的灵 敏度高，特异性好生物分子检测技术及其应用。 本论文主要研究内容包括以下几个方面： 1)人端粒酶是一种广谱的癌症分子标记物，通过对端粒酶活性进行检测能够给 肿瘤诊断、治疗、抗癌药物筛选、以及明白细胞的生理过程等方面提供有意 义的信息，常规的端粒酶活性检测方法主要利用端粒重复扩增然后电泳检测， 因此费时、灵敏度相对较低、且难以定量化。本研究对端粒重复扩增方法进 行改进，通过对扩增引物对进行生物素化修饰和三联吡啶钌标记，然后进行 扩增。结合本课题组发展的磁珠平台电化学发光技术，扩增产物能够进行一 步的磁原位检测。本方法由于极大的减少了手工操作，因此比较传统的端粒 酶活性检测方法，本方法获得了极好的检测精确性。此外，由于磁平台电化 学发光技术的高灵敏度，本方法检测限较常规方法提高两个数量级。灵敏度 达到实现单个细胞的检测水平，动态范围为1—1000个宫颈癌细胞。 2)基于端粒重复扩增技术的端粒酶活性检测方法尽管灵敏度高，但是由于往往 扩增过程出现的错误可能会导致假阴性或者假阳性的结果。在本论文前期的 基础上，本研究又发明了一种新型的实现无扩增的端粒酶活性检测技术。该 方法通过发明一种新型的基于纳米材料的电化学发光纳米探针，通过对电化 学纳米探针的设计和标记优化，并通过与线性的电化学发光探针检测效率进 行评价，发现其检测效率提高约100倍。通过结合端粒延伸反应、磁珠分离 技术、及原位的电化学发光测量，本研究实现了无扩增、定量化的端粒酶活 性分析。该方法检测灵敏度达到了500个癌细胞。 3 3)本研究前期开发了 在金纳米颗粒上标 研究发展了一种新 标记上大量基于生 米探针，这种改进 具有更好的灵敏度 4)结合探针标记，电1 但是检测小分子仍 分离技术和电化学 谢物环丙沙星进行 恩诺沙星和环丙沙 ml～，检测限分别为10 ml～，检测峰和电泳迁移时间的相 “g ngml。和15ng 对标准偏差均低于4．13％，通过结合有效的样品处理手段，本方法应用于牛 奶样品中两种抗生素的检测，其检测限低于欧盟规定2377／90标准。 5)荧光互相关光谱技术能够高特异的分析分子间的相互作用。本研究内容发展 了一种新的基于荧光互相关光谱的蛋白检测方法，该方法以人凝血酶蛋白为 靶分子进行原理验证。设计一对适体(aptamer)探针，分别标记上两种光谱 ‘上分离的染料分子Cy5和RG6，当这两种适体探针与凝血酶结合之后导致产 生了荧光互相关光谱信号。该方法检测灵敏度低至纳摩尔浓度。由于采用了 双探针检测，因此方法具有好的特异性性。此外，该方法是一种均相的、非 分离的检测方法，因此操作上十分简便。理论上本方法能应用于任何蛋白分 子的高灵敏检测。 6)发展一种快速、灵敏、可靠的转基因物种检测方法可为食品安全检测提供有 力的工具。本研究发展了一种基因磁捕捉技术并结合单分子荧光相关光谱检 测的方法，实现了非PCR的检测转基因物