CYP1A1共转染报告基因模型的建立及其在中药单体影响CYP1A1基因表达筛选的应用.pdf

中文摘要 CYPlAl报告基因模型的建立及在中药单体影响 CYPlAl基因表达筛选的应用 硕士研究生：余嘉俊 专 业：药理学 方 向：药物代谢与药物基因组学 导 师：黄民教授 中山大学临床药理研究所 中山大学药学院药物代谢与药动学实验室 中文摘要 随着现代医药的发展及治疗的需要，绝大多数患者几乎都存在多药并用的情 况，药物相互作用所致的不良反应日趋严重。其中一个重要原因就是与其它药物 合用后，发生了严重的代谢性相互作用。代谢性药物相互作用是指2种或多于2 种药物在同时或前后序贯用药时，在代谢环节产生作用的干扰，结果使疗效增强 甚至产生毒副作用，或疗效减弱甚至治疗失败。最常见的原因是CYP450酶的诱 导和抑制。CYP450酶主要存在于肝微粒体中，在外源性化合物(包括药物和毒 物)的生物转化中起着十分重要的作用，它的活性决定药物的代谢速率，与药物 的清除率有着直接关系，是药物代谢的第一相酶。代谢性药物相互作用中，酶抑 制和诱导引起的药物相互作用占据了绝大部分。因而，了解药物对CYP450表达 水平的调控或对CYP450活性的影响有助于指导临床合理用药及预防药物相互作 用。 CYPlAl是CYP450的一种亚型，其转染活化受到芳香烃受体(砧氓)的调控。 CYPlAl可氧化代谢多环芳香类化合物(PAHs)，将其代谢为具有基因毒性的一 中文摘要 系列的水溶性衍生物，这些衍生物可以接合到DNA结构中，影响DNA的正常功 dioxin)是目前所知CYPlAl最强的诱导剂。 临床上，CYPlAl的活化会导致许多不期望发生的药物相互作用和毒副反 应。因而人们为了预测和控制CYPlAl的活性，开发了许多方法用以检测CYPlAl 在外源化合物作用下的活性，并用以发现CYPlAl的专属诱导剂或抑制剂。荧光 素酶报告基因技术就是这些方法较为先进的一种。其基本原理是将一段需要检测 的基因的调控序列与表达萤火虫荧光素酶的基因序列接合到一起，然后将这段接 合的DNA以质粒的形式导入到细胞中，目标基因的转录活性就会以萤火虫荧光 素酶的多少表达出来。报告基因模型相比经典的方法具有无可替代的优势，具有 很高的普及性和应用性。 因此，本研究的目的是建立和验证CYPlAl荧光素酶报告基因模型，并应用 于筛选常见中药，如银杏，丹参，大黄，白花前胡，紫菀等的有效成分对CYPlAl 酶基因表达的影响，为研究及预测药物相互作用提供依据。 一、人CYPlAl报告基因模型的建立和验证 目的：建立人CYPlAl报告基因模型，为下一步药物诱导及抑制实验提供基础。 方法：采用由德国Tubillgen大学PeterA．Munzel教授构建的三种质粒，分别为 人肝的HepG2细胞和来源于人小肠的LSl74T细胞做为其载体。应用脂质体 Lipofectamine2000将质粒转入细胞。 结果： 1．通过确定细胞的接种量，脂质体的转染比例，最终确定采用质粒 3xDRE建立报告基因模型。 pT81／hCYPlal 2．采用TCDD做阳性对照，通过筛选不同浓度，最终选用10nM做高通量筛选 时的阳性对照的浓度。 结论：本部分采取简单易行而且高效的方法，通过选择合适的质粒，考查并优化 模型。并确定了阳性药物TCDD进行药物诱导实验的最佳浓度，为下一步的筛 选实验提供了可靠的基础。 Ⅱ 中文摘要 二、银杏叶提取物及其它中药单体诱导人CYPlAl基因表达的研究 目的：筛选包括银杏叶提取物，丹参，大黄，前胡，桑白皮，紫苑等常见中药中 的单体化合物对CYPlAl基因基础表达的诱导情况。 方法：采用之前建立的人CYPlAl报告基因模型，在24孔板或48孔板上接种 3xDRE进细胞，4．6h