细菌半数致死量测定张玉晴.ppt

细菌LD50测定方法 报告人：张玉晴 指导老师：李槿年教授 大纲 1 LD50基本概念 2 LD50计算方法 LD50具体操作步骤 3 注意事项 4 半数致死量：LD50（Lethal dose）表示在规定时间内,通过指定感染途径,使一定体重或年龄的某种动物半数死亡所需最小细菌数或毒素量。 1 LD50基本概念 1、寇氏法/改良寇氏法 2、累计法（Reed-Muench法） 3、霍恩氏法（Horn氏法） 4、加权法 5、序贯法 6、固定剂量法 7、logistic模型法 LD50计算方法 2 1、寇氏法/改良寇氏法 公式：LD50= lg -1[Xm –i (∑P – 0.5)] X50=lgLD50 LD50 95%可信限=lg -1（X50 1.96SX50） LD50平均可信限=LD50 （LD50可信限高限-低限）/2 Xm：最大剂量的对数值 i ：相邻两组剂量对数值之差 P：各组动物死亡率，用小数表示 ∑P：各组动物死亡率之总和 n：每组动物数 预试验找出引起0%死亡率和100％死亡率剂量的所在范围 反应量大致呈正态分布 剂量必须按等比级数分布 各组动物数相等 2、累计法（Reed-Muench法） 它是先将实验死亡动物数和存活动物数进行累计加和, 再用加和的数据计算死亡率。在死亡率中有2个数据A和B,且A刚好大于50%,B刚好小于50% 计算方便, 更多地运用在微生物学中, 尤其在稀释分析中 不考虑操作误差, 计算结果不够精确, 粗略判断LD50。 拟态弧菌对草鱼LD50的测定 3 3~5%来苏尔浸泡24h 自来水冲洗 1 5 4 3 2 一、实验准备： 二、细菌总数测定 挑取HX4 单个菌落 10mL生理 盐水重悬 100mLBHI 液体培养基 离心收 集菌体 洗涤菌 体3次 测量菌落大小 30℃ 150r/min 振荡培养24h 8000r/min 离心8min 平板菌落计数法计数 4℃保存用于攻毒 10-1 10-3 10-2 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 30℃倒置培养24h 记录平板上菌落数量，肉眼观察+放大镜检查 数据处理 选取同一稀释度平均菌落数在30～300个之间的平板 1、一个稀释度，平均菌落数在30～300个之间时，乘以稀释倍数报告。 2、如有两个稀释度平均菌落数均在30～300个之间，则应求出两者总菌数之比，比值小于或等于2应报告平均数，大于2则报告其中较小的数字。 3、如所有稀释度的平均菌落数均多于300个，应按稀释度最高的平均菌落数，乘以稀释倍数报告。 4、如所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则按稀释倍数最低的平均菌落数，乘以稀释倍数报告。 5、如所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一个稀释度大于300，而相邻的另一稀释度小于30，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告。 三、攻毒 0.01g/L MS-222 麻醉 0.3mL 1.2×1010 2.4×109 4.8×108 9.6×107 1.9×107 分别腹腔 注射5组鱼 三、攻毒 观察7天内草鱼的发病和死亡情况，记录结果，按Reed-Muench氏法计算LD50 病死鱼无菌解剖，观察内脏病变情况，并用接种环蘸取内脏接种于BHI固体培养基上，30°培养2d，对分离到的细菌进行革兰氏染色镜检。 组别 剂量 CFU/mL 只数 死亡数 存活数 累计结果(result) 生 死 死亡比例 死亡率 1 1.2×1010 5 5 0 14/14 100.0% 2 4.0×109 5 4 1 9/10 90.0% 3 1.3×109 5 3 2 5/8 62.5% 4 4.4×108 5 2 3 2/8 22.2% 5 1.5×108 5 0 5 0/11 0.0% LD50=4.2×107CFU/mL 0 表1 HX4菌对斑马鱼的毒力（LD50） 1 3 6 11 14 9 5 2 0 数据汇总： 组别 稀释比例 死亡率 1 原液 100% 2 1:3 90.0% 3 1:9 62.5% 4 1:27 22.2% 5 1:81 0.0% 7、L