血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子活性测定酶联免疫分析试剂盒研制与临床应用.pdf

血管性血友病因子瑞斯托霉索辅因子活性测定的酶联免疫分析试剂盒的研制及临床应用 中文摘要 血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子活性测定的 酶联免疫分析试剂盒的研制及临床应用 中文摘要 研究背景： Willebrand 血管性血友病因子(von factor，vWF)是一种大分子量的具有粘附功 能的多聚体糖蛋白，在止血和血栓过程中发挥着重要作用。首先，vWF可通过与血小 b和受损伤内皮细胞暴露的胶原之间的桥联作用介 板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)I 导血小板粘附到血管壁：其次，vWF作为凝血因子Ⅷ的载体，保护因子Ⅷ免受活化的 Willebrand’s 蛋白C降解。vWF量的减少或质的异常均能导致血管性血友病(von 表明其患病率约为社会人群的0．1～1％，有出血表现需要治疗者约1／1万。由于vWD 患者vWF抗原水平可能正常，因此除检测v岍抗原外，还应同时检测v岍的活性。血 ristocetineofactor 浆v岍瑞斯托霉素辅因子活性(vWF 最常用的vWF活性检测试验，有利于血管性血友病诊断、分型和治疗监测。国内目前 immunosorbent 瑞斯托霉素辅因子活性测定的酶联免疫分析方法(enzyme．1inked assay，ELISA)，该法与聚集法相比批内和批间差异小：重复性好；不需要使用血小 板，而使用重组真核表达OPIba 了具有自主知识产权的抗血小板GPIba单克隆抗体(monoelonal 一151替代国外的2D4，降低检测成本，建立一种操作简单，特异性、敏感性高的检 测方法，并可制成国产化的ELISA试剂盒，更易于临床推广应用。为中国人群中v、tVD 患者尤其是2型vWD的分子病理机制研究及明确诊断和分型提供更可靠的依据，有 助于临床医生对vWD的诊断和治疗，将具有较大的经济和社会效益。 中文摘要 血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子活性测定的酶联免疫分析试剂盒的研制及临床应用 目 的： 盒打下基础。 (2)制备重组血小板膜糖蛋白Iba(ffGPIba)纯品。 (3)应用抗GPIba 敏度、批内和批间差异等方法学考核。 (4)将该方法用于临床标本检测并评价其临床诊断价值。 方法： SZ．151。 (1)应用标准的杂交瘤技术，制备l株抗GPIba的mAb (2)用真核细胞(CHO细胞)培养表达rfGPIba Fc段)， H1-V289(包含IgG 用亲和层析法纯化rfGPIbaH1．V289，并用生化手段鉴定其纯度、免疫学活性和生 物学活性。 H1．V289反应后，再加入待测血浆和瑞斯托霉素，小剂量瑞斯托霉素可诱导血浆 vWF和GPIba结合，最后加入辣根过氧化物酶(horseradish 酶标仪读取吸光度值(OD)。 辅因子活性，对其灵敏度及批内、批间差异进行方法学评估，与国外的抗GPIba单 抗2D4．IgG包板所测结果进行比较，并分析与vWF抗原、胶原结合实验的相关性。 结果： (1)成功制备和鉴定了1株抗人GPIba 显示，SZ．151对瑞斯托霉素辅因子活性无抑制作用。 ffGPIba (2)每1L培养上清液可纯化获得2 H1-V289蛋白纯品。 mg (3)成功建立Rcof-ELISA检测试剂盒。 limit，DL)为0．01U／dL。