负载BFGF明胶壳聚糖缓释微球的人脱细胞羊膜构建人工活性真皮研究.pdfVIP

负载BFGF．明胶．壳聚糖缓释微球的人脱细胞羊膜构建人工活性真皮的研究 负载BFGF-明胶一壳聚糖缓释微球的人脱细 胞羊膜构建人工活性真皮的研究 专 业：外科学 硕士研究生：武日东 导 师：唐庆副教授 中文摘要 目的 采用组织工程学技术，通过制备负载人重组碱性成纤维细胞生长因子 (rh—BFGF)的人脱细胞羊膜细胞外基质(HAAM)，再将人真皮成纤维细胞培养 于HAAM支架上，来探讨构建一种新型人工活性真皮的可行性。 方法 l、人幼儿包皮成纤维细胞的原代及传代培养； 2、去垢剂一酶消化法制备人脱细胞羊膜细胞外基质(HAAM)，扫描电镜观察 及检测其表匦结构及孔隙率和孔隙大小，MTT法检测HMM细胞毒性； 3、BFGF-明胶一壳聚糖缓释微球的制备，扫描电镜观察其表面特性，绘制药 物缓释曲线，MTT法检测缓释微球细胞毒性； 4、BF(；F基体式负载于HAAM，绘制药物缓释曲线，BF6F-明胶一壳聚糖缓释微 球于HAAM上的负载，扫描电镜观察负载情况； 明胶～壳聚糖缓释微球的队AM上培养，扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况， western blot检测三种支架上生长的成纤维细胞层粘连蛋白表达情况。 负载BFGF-明胶．壳聚糖缓释微球的人脱细胞羊膜构建人工活性真皮的研究 勿士田 ：口木 l、组织块法原代培养小儿包皮成纤维细胞，组织块贴壁5天左右即可观察 到有梭形的成纤维细胞从组织块边缘爬出，逐渐围绕组织块以环形放射状向外生 长，细胞形态及增殖活性良好。传代后细胞生长速度快，形态好，显示活性良好。 2、制备的脱细胞羊膜为白色半透明状的薄膜，复水后柔韧性好。扫描电镜 下可见纵横交错的编织状纤维结构，支架的表面及内部有较高的孔隙率，孔隙不 为l级，表明材料无细胞毒性，均为合格。 3、扫描电镜观察BFGF一明胶一壳聚糖缓释微球表面形态显示微球分散较均匀， 呈球形，粒径均匀，球体表面光滑；体外缓释曲线显示载药微球在前24dx时内突 释情况比较明显，累积释放量达到45％。此后进入缓释期，药物缓慢释放，到7 天时，药物累积释放量达到90％。 4、BFGF基体式负载于HAAM的药物释放曲线显示药物初期释放速度很快，尤 其是前24h内，药物累计释放达85％，至第7天释放达95％。扫描电镜观察显示 释微球细胞毒性显示材料毒性分级为l级，表明材料无细胞毒性，均为合格。 blot检测培养三天的 5、人真皮成纤维细胞在三种支架上生长良好，western 三种支架上成纤维细胞层粘连蛋白表达情况显示：未负载BFGF的HAAM，基体式负 胞所表达的层粘连蛋白量依次增加。 结论 l、通过组织块法培养幼儿包皮，可以获得形态及增殖活性良好的真皮来源 的成纤维细胞，不同代的成纤维细胞具有相似的增殖周期； 2、通过酶一去垢剂法所制备的人脱细胞羊膜细胞外基质，完整地去除了细 胞成分而不损伤胶原支架结构，且无细胞毒性； 3、通过明胶一壳聚糖微球负载BFGF可以制备一个良好的BFGF缓释系统， 无细胞毒性，可以起到缓慢、持续地释放BFGF的作用； 4、人真皮成纤维细胞种植于负载BFGF-明胶一壳聚糖缓释微球的队枷上， Ⅱ 负载BFGF．明胶．壳聚糖缓释微球的人脱细胞羊膜构建人工活性真皮的研究 BFGF的持续缓慢释放及层粘连蛋白的高表达可以促进移植物的血管化，为构建 一种新型的人工活性真皮奠定了实验基础。 关键词 组织工程控释系统脱细胞羊膜人工活性真皮 ⅡI 负载BFGF-明胶．壳聚糖缓释微球的人脱细胞羊膜构建人工活性真皮的研究 acellular Constructionofartificialbioactivedermishuman