遗传性无纤维蛋白原血症及其巨大血小板综合征的临床和分子致病机理的研究.pdfVIP

遗传性无纤维蛋白原血症及巨大血小板综合征的临床和分子致病机理研究 中文摘要 遗传性无纤维蛋白原血症及巨大血小板综合征的临床和 分子致病机理研究 中文摘要 随着近年来人类基因组序列图的完成和分子生物学在止血与血栓研究中取得的 巨大进展，几乎所有的凝血因子及血小板膜糖蛋白以及其他相关的成分基因都已被克 隆，其结构以及功能的关系也基本阐明。目前很多遗传性出血性疾病的基因异常已被 发现，基因诊断也成为今后遗传性出血性疾病研究的发展的主要方向。遗传性无纤维 蛋白原血症（Congenital afibrinogenemia ）是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，50% 发生在近亲婚配家系，发病率约为百万分之一。脐带出血常为首发症状，其后出血症 状可以是皮下出血、鼻出血、血尿、女性可以表现为月经血过多，颅内出血为其主要 死亡原因。巨大血小板综合征（Bernard-Soulier syndrome，BSS) 是一种罕见的先天 性遗传性血小板疾病，为常染色体隐性遗传。主要是由于血小板膜GPIb和GPIX先天 性质或量的缺陷所致。以出血时间延长、血小板数量减少、血小板体积巨大为特征。 本研究分为两部分： 第一部分 纤维蛋白原Bβ 链插入突变导致遗传性无纤维蛋白原血症的 发病机制 对1 例有近亲婚配家族史的遗传性无纤维蛋白原血症家系进行了表型诊断、基因 分析、功能检测和体外细胞实验，以探究其分子发病机制。应用 Clauss 法和免疫比 浊法测定血浆纤维蛋白原（Fg ）含量，提取先证者及其家系成员外周血DNA，进行 PCR 法扩增纤维蛋白原FGA 、FGB 和FGG 基因所有外显子和侧翼序列，构建纤维蛋 白原野生型和突变型质粒进行细胞转染。在患者血浆中加入凝血酶进行纤维蛋白聚集 曲线测定；应用Western blot 检测血浆纤维蛋白原，用含有FGA，FGB ，FGG 全长 编码序列的基因或FGB 突变型质粒转染COS-7 细胞后，用Western blot 法和ELISA 法检测转染后的细胞裂解液及细胞培养上清。 I 中文摘要 遗传性无纤维蛋白原血症及巨大血小板综合征的临床和分子致病机理研究 研究结果显示先证者的APTT ﹥200s，PT ﹥100s，TT ﹥100s；用Clauss 法和免疫 比浊法在先证者血浆中检测不到 Fg ，先证者父亲、母亲、胞弟和儿子的血浆纤维蛋 白原活性比正常对照略低; 基因分析发现先证者在FGB exon 2 核苷酸2833～2834 之 间插入GTTT ，该突变为纯合改变，导致纤维蛋白原分子Bβ 链在40 位氨基酸处发生 移码并在50 位氨基酸处提前终止。该突变在先证者父亲、母亲、胞弟和儿子为杂合 突变；血浆纤维蛋白聚集曲线显示了先证者凝血酶诱导的纤维蛋白聚集曲线无光吸收 度，与正常对照相比，患者血浆中无纤维蛋白聚集。免疫蛋白印迹检测血浆中 Fg ， 在非还原条件下缺乏完整的纤维蛋白原分子和纤维蛋白原半分子。而在还原条件下， 先证者血浆中无法检测到截短的Bβ 链。 Western blot 分析转染突变型的COS-7 细胞裂解液，检测到﹥340KDa 异常纤维 蛋白原分子，这表明该突变导致纤维蛋白原分子在细胞内组装异常，突变型细胞上清 中未检测到纤维蛋白原分子。野生型和突变型质粒转染COS-7 细胞后，ELISA 法检 测细胞裂解液中纤维蛋白原浓度，两者无明显差异；检测细胞培养上清中纤维蛋白原 浓度，突变型明显低于野生型。细胞表达实验说明该突变体虽然能在细胞内合成纤维 蛋白原分子，但突变的纤维蛋白原分子组装异常和分泌障碍。该基因突变是本家系先 证者遗传性无纤维蛋白原血症的发病原因，此突变为国际首例报道。 第二部分 巨大血小板综合征糖蛋白Ibα 基因异常的分子生物学研究 应用分子生物学方法证实Ibα 基因c.1444 del A 导致巨大血小板综合征（BSS ） 并深入探讨该突变在 BSS 发病中的意义。采集患者及其父母血标本进行血常规、出 血时间；ADP 、胶原、瑞