《一株高产丝氨酸羟甲基转移酶基因工程菌的构建及发酵产酶条件优化》.pdfVIP

第 36卷第 3期 武 汉 科 技 大 学 学 报 Vo1．36。No．3 2013年 6月 JournalofWuhanUniversityofScienceandTechnology Jun．2013 一 株高产丝氨酸羟 甲基转移酶基因工程茵的构建 及发酵产酶条件优化 喻 放 ，左振宇，杨忠华 ，周 卫 (武汉科技大学化学工程与技术学院，湖北 武汉 ，430081) 摘要 ：以E．coliAB90054基 因组 中DNA为模板 ，采用 PCR方法扩增得到glyA基 因，将该基 因克隆到表达栽 体 pET28a(+)中，转化表达菌株 BL21(DE3)后筛选阳性重组子 ，并对筛选所得高表达基 因工程菌G16进行 培养条件和表达条件的优化 。结果表 明，当培养条件为 38℃、PH为 7．0、转速为 150r／min时，基 因工程茵 的生长速度和茵液浓度最佳 ；当表达条件的诱导温度为 3O℃、诱导剂浓度为 0．5mmol／L、诱导时间为 5h 时，基 因工程茵诱导 目的蛋白表达效果最好 。通过 SD PAGE分析和酶活测定后发现 ，在优化条件下基 因工 程茵 G16发酵产丝氨酸羟 甲基转移酶能力 占茵体总蛋 白的6O 左右 ，且蛋 白活性正常。 关键词 ：glyA基 因；丝氨酸羟甲基转移酶 ；基 因工程 ；发酵产酶 中图分类号 ：Q812 文献标志码 ：A 文章编号 ：1674-3644(2013)03—0219—06 L一丝氨酸是生糖氨基酸 ，由于其处于多条代 诱导表达条件口 ](如诱导剂种类 、浓度 、诱导时 谢途径 ，难以从生物体内直接大量分离 ，故具有许 间、诱导温度)等。只有在特定环境下 ，基 因工程 多重要 的生理功能和作用，在化工 、制药、食 品、化 生物才能表现 出最佳的生产能力。为此 ，本文以 妆 品和生物农药等行业有着广泛 的应用 口]。近 菌株产酶的酶活力为测量指标 ，在单 因素实验基 年来 ，由于发现丝氨酸衍生物具有抗癌功效[3]，使 础上通过正交实验考察培养温度 、pH 以及溶氧 得其需求量 日益增大 ，是市场上价格最 昂贵的氨 条件、诱导剂添加量和诱导时间等因素对其基 因 基酸之一。丝氨酸羟 甲基转移酶 (SHMT)是体 工程菌发酵产酶 的影响，以期为发酵高效生产丝 外酶促法制备 L一丝氨酸 的关键酶l4]，它是以5一磷 氨酸羟 甲基转移酶条件 的优化提供依据。 酸吡哆醛 (5-PLP)为辅酶 的吡哆醛酶 ，能在 四氢 l 实验材料与方法 叶酸 (THF)存在 的条件下催化 甲醛与甘氨酸缩 合生成 L一丝氨酸 。利用体外酶促法生产 L一丝氨 1．1 材料 酸 ，获得大量的、高活力的丝氨酸羟甲基转移酶制 本实验所用材料分别为 E．coliAB90054菌 备物是提高 L一丝氨酸产量的关键 。虽然 glyA基 株 、质粒载体 pMD18一T、表达载体pET28a(+)和 因编码的丝氨酸羟 甲基转移酶广泛存在于动植物 表达菌株感受态细胞 BL21(DE3)。所用试剂分 和微生物中，但 由于生物体基因表达 自我调控 ，使 别为限制性内切酶BarnHI，NdeI、T4DNA连接 得 自然界生物体 内的丝氨酸羟 甲基转移酶以本底 酶 、TaqDNA 聚合酶、DNAMarker以及蛋白质 、 表达微量存在 ，而以基 因工程法高效表达丝氨酸 十六烷基三 甲基溴化铵 、磷酸吡哆醛 、D，L一苯基 羟 甲基转移酶蛋 白成为解决此 问题 的有效途径。 丝氨 酸、异 丙 基一B—D-硫 代 吡 喃 半 乳 糖 苷 和 选育或构建一株优 良菌株仅仅是开始 ，要使