副猪嗜血杆菌hhdA基因缺失株的构建及胞外丝氨酸蛋白酶免疫原性的研究.pdfVIP

摘要 下可引起以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征的革拉泽氏病(Glasser，SDisease)。近年 来，该病在保育猪群中的发生逐年上升，已成为危害养猪业的重要传染病之一，受到人们的日益 重视。虽然近几年加大了该病原的研究力度，筛选出大量的毒力相关基因，但目前为止尚不十分 清楚HPS的致病机理。 PCR)的方法构建了HPShhdA基因的外源打靶基因 本研究利用重叠PCR(ovedapping Hup．Kan．Hdown。将其连接至自杀性质粒载体pDSl32，获得了可在宿主菌E．coli SMl0Lpir中 性筛选和蔗糖负筛选，得到HPS 化特性及NAD生长依赖性未见改变。生长曲线的测定表明该突变株的生长慢于标准株。豚鼠感 染试验表明毒力变化不明显。说明hhdA基因不影响I-IPS的生长、繁殖，与其致病力无明显相关 性。本试验建立的lIPS遗传操作突变系统为实验室日后验证lIPS各种基因功能奠定基础。 serine 本研究对HPS的一种胞外丝氨酸蛋白酶(extmeellular protease，esp)进行了序列分析 并将该蛋白进行原核表达。HPS esp一级结构分析表明，前23个氨基可能为信号肽序列。C端转 运单位氨基酸序列的系统进化树表明，该蛋白与流感嗜血杆菌中IgA蛋白酶的亲缘关系较近。承 等6个氨基酸序列表位抗原的可能性较大。将克隆的esp基因连接至表达载体pET30a，构建了表 达质粒pET-esp。将测序鉴定正确的重组表达质粒利用IPTG进行诱导表达。经大量诱导条件优 化试验，得到了IPTG终浓度为0．6mmol／L，32℃振荡培养6h的最优表达条件。SDS．PAGE分 析显示表达产物的分子量约为82kDa。以该蛋白为抗原，加入等体积的206佐剂免疫豚鼠，3次 免疫后以浓度为5×109CFU／mL的菌液进行攻击试验，每只豚鼠注射l mL。结果表明，esp可以 部分保护lIPS的感染(6／12)，有望成为lIPS病免疫诊断和疫苗研制的候选抗原。 关键词：副猪嗜血杆菌，hhdA基因，突变株，胞外丝氨酸蛋白酶，免疫原性 Abstract acommensalofthe tractof ffrPs)is organismupperrespiratoryhealthy Haemophilusparasuis bacteriacauseGl／isser’S fibrinous conditions，this disease，characterizedby pigs．Underappropriate and diseasehas asoneofthe meningitis．Gl／tsser’Srecentlyemerged typical polyserositis，arthritis inswine inthe has attented bacterialdiseases industry worldwide，which bypeople． increasingly studiesonHPShavebeen aswellasseveralvirulencefactorshave