ibv s1蛋结合组织细胞膜蛋白和干扰cek细胞感染作用.pdfVIP

摘要 摘 要 鸡传染性支气管炎(AvianInfectiousBronchitis，IB)是由冠状病毒科冠状病毒属的鸡传 Bronchitis 染性支气管炎病毒(InfectiousVirus，IBV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道 传染病，一直是危害世界养禽业的最重要的疫病之一。目前常见IB的临床型是呼吸型和肾型， 且之间免疫原性差异较大，致使现有疫苗免疫效果不够理想。 IBV有3个主要结构蛋白：S蛋白、M蛋白和N蛋白。S蛋白是IBV非常重要的一个结 构蛋白，转译后分为Sl和S2糖蛋白。IBV的S1蛋白一直被认为能激发中和抗体和血凝抑 制抗体，并与病毒的组织嗜性有关。S蛋白与宿主细胞膜上的受体结合可能是IBV吸附细胞 的前提条件，Sl基因的变异，将直接影响到病毒与细胞膜受体的结合。本研究主要对IBV 典型毒株呼吸型M41株和肾型Holte株的S1基因利用昆虫细胞表达系统进行了重组表达， 试对其的免疫原性、组织膜蛋白亲嗜性及其与宿主细胞黏附情况进行比较分析。 本试验主要的研究内容、方法和结果如下： 1．根据GenBank中己发布的IBVS1基因，设计并合成了1对特异性引物，采用RT-PCR 技术扩增S1基因，并进行克隆和测序。本试验扩增出的S1基因所用的病毒是将本实验室保 存IBVM41株和Holte株在CEK细胞盲传三代后又在SPF鸡胚中繁殖七代的鸡胚尿囊液病 655 毒。测序结果表明，IBVM41和Holte株所克隆的S1基因片段大小分别为1654 bp和1 bp。 序列比较分析，克隆的IBV 性为99．52％，氨基酸同源性为99．3％；IBV 基因核苷酸同源性为99．76％，氨基酸同源性为99．69％；两种毒株s1基因核苷酸同源性为 81．61％，氨基酸同源性为89．86％。 2．本试验利用Bac40．Bac真核表达系统构建了表达两株S1蛋白的重组杆状病毒。将两 株重组杆状病毒分别感染Sf9细胞后，用IFA、SDS．PAGE和Westernblot等方法检测St9细 IBV 胞中蛋白的表达。经检测，在SD细胞中得NT M41株和Holte株的Sl蛋白，蛋白分 子量约为64ku。通过分子量大小可知，得到两株病毒的S1蛋白糖基化均不完全，但仍然具 有抗原活性。 3．将IBVM41株和Holte株重组s1蛋白的细胞裂解液与等体积弗氏完全佐剂充分融合 后，分别对1日龄的SPF雏鸡进行免疫，采集免疫后的血清，利用SPF鸡胚进行病毒．血清 交叉中和试验。试验结果表明，本试验表达的两株S1蛋白可以诱导抗体产生并有良好的免 疫保护力，两株S1蛋白的免疫血清也有一定程度的交叉保护能力。 4．本试验首次利用间接ELISA方法验证S1蛋白与不同组织细胞膜蛋白结合情况，初步 推断其在体外与各组织细胞膜蛋白的亲嗜性。用提取的4日龄SPF雏鸡的气管、心脏、肝脏、 肺脏、肾脏、腺胃、十二指肠、法氏囊、胸腺和脾脏等组织细胞膜蛋白包被，用纯化的S1 蛋白与其作用，再用IBV阳性血清与HRP标记的羊抗兔IgG检测结合情况。两株S1蛋白分 别与肺脏膜蛋白结合差异均极显著，M41株S1蛋白的结合能力高于Holte株；与肾脏、气管 和腺胃膜蛋白结合差异显著，其中Holte株s1蛋白与肾脏及腺胃膜蛋白结合能力高于M41 东北农业大学农学硕士学位论文 株，而M41株Sl蛋白与气管膜蛋白的结合能力高于Holte株；两毒株sl蛋白与法氏囊、肝 脏、脾脏、十二指肠、胸腺及心脏膜蛋白结合差异不显著。这说明不同致病性IBV毒株与各 组织细胞膜蛋白的结合力存在差异，且该差异可能与IBV的组织嗜性变化有关。 5．为研究Sl蛋白对宿主细胞的黏附和／或封闭能力，本试验将纯化的S1蛋白与CEK细 胞作用后观察IBV对CEK细胞的影响。IBVM41．S1蛋白和IBVHolte．S1蛋白浓度均按0．5 gg、0．75pg和1 两氏法计算得出，IBV mL和